的拷貝數(shù)、改變基因的啟動(dòng)子（例如使用弱 啟動(dòng)子）等。如本文所用，術(shù)語"基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性抑制"具有本領(lǐng)域內(nèi)熟知的含 義，是指基因轉(zhuǎn)錄翻譯后產(chǎn)生的蛋白活性的降低。其可以例如通過基因表達(dá)強(qiáng)度的降低、基 因中核苷酸的插入或缺失、氨基酸位點(diǎn)的突變來實(shí)現(xiàn)。實(shí)現(xiàn)"基因表達(dá)的抑制"以及"基因 所編碼的蛋白質(zhì)的活性抑制"的各種技術(shù)手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
[0072] 在第二方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)化工原料的方法，其中包括培養(yǎng)本發(fā)明的重 組大腸桿菌的步驟。
[0073] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括培養(yǎng)本發(fā)明的重組大腸桿菌的步驟，以及 任選的分離或純化所得的化工原料的步驟。
[0074] 本發(fā)明的方法可以用于生產(chǎn)各種可通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生的化工原料，包括但不限 于：丁二酸、D-乳酸、L-乳酸、乙醇、丁醇和1，3-丙二醇等。
[0075] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的"培養(yǎng)"包括種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)。
[0076] 如本文所用，術(shù)語"種子培養(yǎng)"是指將用于發(fā)酵的菌種在固體培養(yǎng)基上活化后，再 經(jīng)過搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種的過程。
[0077] 如本文所用，術(shù)語"發(fā)酵培養(yǎng)"是指利用微生物菌種，在適宜的條件下，將培養(yǎng)基組 分經(jīng)過特定的代謝途徑轉(zhuǎn)化為某些特定產(chǎn)物的過程。
[0078] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中包括將本發(fā)明的大腸桿菌厭氧發(fā)酵。
[0079] 如本文所用，術(shù)語"厭氧發(fā)酵"是指利用厭氧發(fā)酵菌株，在隔絕空氣的條件下，經(jīng)特 定代謝途徑將培養(yǎng)基組分轉(zhuǎn)化為某些特定產(chǎn)物的過程。
[0080] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中的培養(yǎng)過程不進(jìn)行任何通氣步驟。
[0081] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明中對(duì)大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)的方法包括以下步驟：
[0082] (1)將本發(fā)明的重組大腸桿菌接種于種子培養(yǎng)基，在適宜大腸桿菌生長的條件下 培養(yǎng)一段時(shí)間得到種子液；
[0083] (2)將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在厭氧條件下培養(yǎng)。
[0084] 本發(fā)明的方法中可以使用本領(lǐng)域中常規(guī)用于培養(yǎng)大腸桿菌的各種培養(yǎng)條件，例如 培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和是否搖動(dòng)以及搖動(dòng)速度等。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)需要可以選 擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件。本發(fā)明的方法中所使用的培養(yǎng)條件以及發(fā)酵條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟 知的（諸葛健等，1994,工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)，中國輕工業(yè)出版社）。
[0085] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)條件包括但不限于：溫度為30_45°C，例如 30-31 °C、31-32 °C、32-33 °C、33-34 °C、34-35 °C、35-36 °C、36-37 °C、37-38 °C、38-39 °C、 39-40 °C、40-41 °C、41-42 °C、42-43 °C、43-44 °C、或 44-45 °C。
[0086] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)條件包括但不限于：種子培養(yǎng)的時(shí)間為6-16小 時(shí),例如6-7小時(shí)、7-8小時(shí)、8-9小時(shí)、9-10小時(shí)、10-11小時(shí)、11-12小時(shí)、12-13小時(shí)、13-14 小時(shí)、14-15小時(shí)、或15-16小時(shí)。
[0087] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)條件包括但不限于：發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為2-5天， 例如2天、3天、4天、或5天。
[0088] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)條件包括但不限于：將本發(fā)明的重組大腸桿菌 按照0. 1-10%(V/V)的接種量接種于種子培養(yǎng)基，例如0. 1%、0. 5%、1%、2. 5%、5%、或10%。。 [0089] 在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)條件包括但不限于：將種子液按照終濃度 OD55tl=0.0 5-0. 5 的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，例如 OD55tl 為 0· 05-0. 1、0· 1-0. 2、0· 2-0. 3、 0· 3-0. 4 或 0· 4-0. 5。
[0090] 在一實(shí)施方案中，可以使用常用于大腸桿菌的培養(yǎng)基。用于本發(fā)明的大腸桿菌的 培養(yǎng)基可以包括合適的氮源，例如有機(jī)含氮化合物或無機(jī)含氮化合物或其混合物。在一實(shí) 施方案中，所述有機(jī)含氮化合物例如選自豆餅粉、花生餅粉、牛肉膏、魚粉、酵母膏、蛋白胨、 玉米漿中的一種或任意幾種的混合物，所述無機(jī)含氮化合物選自硝酸鹽（如硝酸鈉、硝酸 鉀、硝酸鈣），銨鹽（如磷酸銨、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨）中的一種或任意幾種的混合物。 在一實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的大腸桿菌的培養(yǎng)基可以包括合適的碳源，例如選自葡萄糖、 淀粉、淀粉水解糖、果糖、糊精、乳糖、半乳糖、木糖、蔗糖、甘油、麥芽糖、脂肪酸、乙酸、丙酮 酸、和富馬酸中的一種或任意幾種的混合物。
[0091] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中所使用的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基由以下成 分組成（溶劑為水）：
[0092] 大量元素：葡萄糖、KH2P04、K2HP04、（NH 4) 2HP04、MgSO4 · 7H20、和甜菜堿-KCl ;
[0093] 微量元素：FeCl3 · 6H20、CoCl2 · 6H20、CuCl2 · 2H20、ZnCl2、Na2MoO4 · 2H20、 MnCl2 · 4H202、和 H3BO3。
[0094] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)基由以下成分組成（溶劑為水）：
[0095] 大量元素：葡萄糖 20-120g/L，KH2P042-5g/L、K2HP044-8g/L、（NH 4) 2HP043-5g/L、 MgSO4 · 7Η200· 1-0. 3g/L、以及甜菜堿-KC10. 1-lg/L ;
[0096] 微量元素：FeCl3 · 6Η201-5 μ g/L、CoCl2 · 6Η200· 05-1 μ g/L、CuCl2 · 2Η200· 05-1 μ g/ L、ZnCl20.0 5-1 μ g/L、Na2MoO4 · 2Η200· 05-1 μ g/L、MnCl2 · 4Η2020· H μ g/ L, H3BO30.0 1-0. 5 μ g/L〇
[0097] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明生產(chǎn)丁二酸的方法中，發(fā)酵培養(yǎng)本發(fā)明的重組大腸桿 菌的步驟包括使用高濃度的葡萄糖和/或高濃度的丁二酸鹽。在一個(gè)實(shí)施方案中發(fā)酵培養(yǎng) 本發(fā)明的重組大腸桿菌的步驟包括使用高濃度的葡萄糖和/或高濃度的丁二酸二鈉。
[0098] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的高濃度葡萄糖是指100g/L以上的葡萄糖，例如 100-150g/L、100-200g/L、100-250g/L、100-300g/L。在一個(gè)實(shí)施方案中本發(fā)明所述的高濃 度葡萄糖是至少ll〇g/L、至少120g/L、至少130g/L、至少140g/L、至少150g/L、至少160g/ L、至少 170g/L、至少 180g/L、至少 190g/L、至少 200g/L、至少 210g/L、至少 220g/L、至少 230g/L、至少 240g/L、至少 250g/L、至少 260g/L、至少 270g/L、至少 280g/L、至少 290g/L、至 少300g/L甚至更高的葡萄糖。
[0099] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的高濃度丁二酸鹽是指29g/L以上的丁二酸鹽， 例如 29-50g/L、29-60g/L、29-70g/L、29-80g/L、29-90g/L、29-100g/L、29-150g/L、29-200g/ L、29-250g/L、29-300g/L。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的丁二酸鹽的濃度是例如至少 29g/L、至少 30g/L、至少 40g/L、至少 50g/L、至少 60g/L、至少 70g/L、至少 80g/L、至少 90g/ L、至少 100g/L、至少 110g/L、至少 120g/L、至少 130g/L、至少 140g/L、至少 150g/L、至少 160g/L、至少 170g/L、至少 180g/L、至少 190g/L、至少 200g/L、至少 250g/L、至少 300g/L，例 如至少43g/L、至少57g/L、至少71g/L、至少86g/L甚至更高的丁二酸二鈉。在一個(gè)實(shí)施方 案中，本發(fā)明所述的高濃度丁二酸鹽是高濃度的丁二酸二鈉。
[0100] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明中對(duì)大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)的具體方法如下：
[0101] 將菌株厭氧發(fā)酵，包括以下步驟：
[0102] (1)種子培養(yǎng)：將1/3-1/2體積的種子培養(yǎng)基置于三角瓶中，高溫高壓滅菌。冷卻 后將本發(fā)明的重組大腸桿菌按照0. 1-10%(V/V)的接種量接種于種子培養(yǎng)基，在37°C以及 搖動(dòng)的條件下培養(yǎng)6-16小時(shí)得到種子液，用于發(fā)酵培養(yǎng)基接種；
[0103] (2)發(fā)酵培養(yǎng)：將1/3-1/2體積的發(fā)酵培養(yǎng)基體積置于厭氧發(fā)酵罐中，將種子液按 照終濃度OD55tl=0.0 5-0. 5的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)2-5天，得到發(fā)酵液。
[0104] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明生產(chǎn)化工原料的方法中還包括從發(fā)酵液中收集、提取、 分離和/或純化所得的化工原料的步驟。
[0105] 在第三方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的重組大腸桿菌在生產(chǎn)丁二酸中的用途。
[0106] 在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了提高大腸桿菌耐滲透壓能力的方法，所述方法包括 在大腸桿菌中引入選自如下的一種或多種突變的基因：(a)突變的rpoB基因，其所編碼的 多肽在對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. : 1所示氨基酸序列的位置D654的位置上含有修飾；(b)突變的 cusS基因，其所編碼的多肽在對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. : 2所示氨基酸序列的位置G210的位置上 含有修飾；和（c)突變的mreC基因，其所編碼的多肽在對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. : 3所示氨基酸序 列的位置G24的位置上含有修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的提高大腸桿菌耐滲透 壓能力的方法是提高大腸桿菌耐受高濃度葡萄糖和/或高濃度丁二酸鹽的能力的方法。在 一個(gè)實(shí)施方案中，所述丁二酸鹽是丁二酸二鈉。
[0107] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中所述突變的rpoB基因所編碼的多肽在對(duì)應(yīng) 于SEQ ID No. : 1所示氨基酸序列的位置D654的位置上是用Y置換D。
[0108] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中所述突變的cusS基因所編碼的多肽在對(duì)應(yīng) 于SEQ ID No. : 2所示氨基酸序列的位置G210的位置上是用V置換G。
[0109] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中所述突變的mreC基因所編碼的多肽在對(duì)應(yīng) 于SEQ ID No. : 3所示氨基酸序列的位置G24的位置上是用D置換G。
[0110] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了提高大腸桿菌耐滲透壓能力的方法，所述方法 包括在大腸桿菌中引入選自如下的一種或多種突變的基因：(a)突變的rpoB基因，其核苷 酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. : 4所示核苷酸序列的位置G1960的位置上含有修飾；(b)突變 的cusS基因，其核苷酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. : 5所示核苷酸序列的位置G629的位置上 含有修飾；和（C)突變的mreC基因，其核苷酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. : 6所示核苷酸序列 的位置G71的位置上含有修飾。
[0111] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述方法包括在大腸桿菌中同時(shí)引入2種所述突變的 基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述方法包括在大腸桿菌中同時(shí)引入3種所述突變的基 因。
[0112] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中包括在大腸桿菌中引入如下的突變的基因： (a)突變的rpoB基因，其核苷酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. : 4所示核苷酸序列的位置G1960 的位置上含有修飾；和（b)突變的cusS基因，其核苷酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. : 5所示核 苷酸序列的位置G629的位置上含有修飾。
[0113] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中包括在大腸桿菌中引入如下的突變的基因： (a) 突變的rpoB基因，其核苷酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. : 4所示核苷酸序列的位置G1960 的位置上含有修飾；和（c)突變的mreC基因，其核苷酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. : 6所示核 苷酸序列的位置G71的位置上含有修飾。
[0114] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中包括在大腸桿菌中引入如下的突變的基因： (b) 突變的cusS基因，其核苷酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. : 5所示核苷酸序列的位置G629的 位置上含有修飾；和（c)突變的mreC基因，其核苷酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. : 6所示核苷 酸序列的位置G71的位置上含有修飾。
[0115] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中包括在大腸桿菌中引入如下的突變的基因： (a)突變的rpoB基因，其核苷酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. : 4所示核苷酸序列的位置G1960 的位置上含有修飾；(b)突變的cusS基因，其核苷酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQ IDNo. : 5所示核苷酸 序列的位置G62