一種脂肪組織來源的間充質干細胞的擴增培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學工程技術領域，具體的涉及一種脂肪組織來源的間充質干細 胞的擴增培養(yǎng)方法。
【背景技術】
[0002] 在脂肪組織中含有大量的具有多向分化潛能及自我復制能力的間充質干細胞，稱 為脂肪干細胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs)，他們來源廣泛、取材容易，具有向脂 肪、骨、軟骨、肌肉、內皮、造血、肝、胰島和神經等多種細胞方向分化的多分化潛能，有希望 成為組織工程新的種子細胞。因脂肪干細胞具有分化為脂肪的潛能，且其具有易獲得性、可 迅速擴增、不衰老等特點，目前脂肪干細胞已經成為脂肪組織工程中組織細胞的研宄熱點。
[0003] 在治療面部老化的應用中，發(fā)現在皮下注射脂肪組織會使皮膚年輕化，植入的脂 肪組織存活后，不但有體積膨脹效果，而且合成了新膠原質，使植入部位皮膚變得緊實，并 且植入的脂肪組織在植入部位生成了新的血管，并形成了新的生理平衡。后期認為脂肪組 織中含有的ADSCs發(fā)揮了作用，其分化刺激大量I型膠原蛋白及少量V型和VI型膠原蛋白 的生成、成纖維細胞的重組、分泌大量新的細胞基質成分，從而修復原有的真皮斷裂，重建、 修復皮膚結構，達到消除皺紋的目的。
[0004] 脂肪干細胞分化為表皮細胞對臨床上解決嚴重創(chuàng)傷，大面積燒傷患者的皮膚來源 緊張問題和促進難愈創(chuàng)面的修復等問題提供了很好的解決方法。但是在廣泛用于臨床之 前，仍有許多問題需要解決，如免疫排斥反應、向其他組織誘導分化研宄等。另外，針對脂肪 干細胞的研宄大多是在體外或者動物體內進行，在人體內復雜的各種體液因子調控下的狀 況尚不清楚。隨著分子生物學和細胞生物學的迅速發(fā)展，促生長分化的各種生物因子以及 模擬體內微環(huán)境的細胞外基質等均將成為研宄熱點，這將為脂肪干細胞成為現代表皮細胞 組織工程學研宄的理想種子細胞并將其最終用于以細胞為基礎的臨床治療提供前提和保 障。
[0005] 在骨組織中，骨外傷、骨腫瘤和先天性畸形患者中常存在大面積的骨缺損。而修復 材料的匱乏一直是臨床面臨的難題之一。傳統骨修復的材料，如肋骨和髂嵴等自體骨，可獲 取的組織量有限。且對取材部位造成損傷：磷灰石和去礦化異體骨等異體材料，存在免疫排 斥、疾病傳染及骨溶解等問題。近年來，干細胞和骨組織工程研宄的不斷深人，為臨床骨缺 損的修復提供了新思路。脂肪干細胞由于來源豐富且容易獲取，體內、外實驗均證實其能分 化形成骨樣組織，已成為骨組織工程重要的種子來源。
[0006] 脂肪干細胞上皮分化在喉組織工程中的應用也很有效，聲帶瘢痕是一個較難解決 的臨床問題，尚缺乏有效的治療手段，目前其主要的治療方法是向聲帶中注射填充物或細 胞，試圖恢復聲帶淺層的振動性。脂肪源干細胞與骨髓源間質干細胞具有相似的遺傳特征， 可以分化成外胚層和內胚層細胞。研宄構建了聲帶黏膜的組織工程替代物，三維的纖維蛋 白和脂肪源干細胞的凝膠與聲帶的固有層和黏膜層有著相似的顯微結構和特性。在研宄 中，成脂肪組織來源的源干細胞可以雙向分化成上皮細胞和間質細胞系，并且具有組織結 構，表皮生長因子和氣體界面是上皮分化的必備條件。研宄結果初步表明，利用組織工程制 作聲帶替代物是可行的。
[0007] 然而，目前脂肪干細胞的應用還有很多需要完善的地方，主要在于分離的脂肪干 細胞體外擴增效率不高，難以獲得大量高純度的脂肪干細胞。因此，本領域迫切需要開發(fā)出 簡便、高效地擴增高純度脂肪干細胞的方法。

【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于克服現有技術的上述不足，提供一種脂肪組織來源的間充質干 細胞的擴增培養(yǎng)方法，旨在解決現有技術中體外培養(yǎng)脂肪間充質干細胞擴增效率不高、難 以獲得大量高純度的脂肪間充質干細胞的技術問題。
[0009] 為了實現上述發(fā)明目的，本發(fā)明實施例的技術方案如下：
[0010] 一種脂肪組織來源的間充質干細胞的擴增培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
[0011] 將分離的脂肪組織來源的間充質干細胞用脂肪干細胞培養(yǎng)基進行重懸處理，得到 含脂肪組織來源的間充質干細胞的重懸液；
[0012] 將所述重懸液接種至干細胞培養(yǎng)器中進行擴增培養(yǎng)；擴增培養(yǎng)24小時后更換所 述脂肪干細胞培養(yǎng)基，之后每兩天更換所述脂肪干細胞培養(yǎng)基一次，待生長融合至80-90% 時，用胰酶消化處理后進行傳代培養(yǎng)；
[0013] 其中，所述脂肪干細胞培養(yǎng)基含有0. 1-lOv/v%胎牛血清、1-lOv/v%慶大霉素和 80-98. 9v/v%高糖DMEM培養(yǎng)基；所述干細胞培養(yǎng)器為用纖維粘連蛋白包被處理的干細胞 培養(yǎng)器。
[0014] 本發(fā)明與現有技術相比，具有以下優(yōu)異技術效果：
[0015] 上述脂肪組織來源的間充質干細胞的擴增培養(yǎng)方法采用纖維粘連蛋白包被脂肪 間充質干細胞生長依附的固相支持物，利用〇. 1-lOv/v%低濃度胎牛血清和1-lOv/v%高 濃度慶大霉素的協同增效篩選培養(yǎng)，使得脂肪組織來源的間充質干細胞在兩周時間內能擴 增400-500倍，因此，本發(fā)明脂肪組織來源的間充質干細胞的擴增培養(yǎng)方法高效、工藝簡 單。另外，經流式細胞術鑒定具有脂肪間充質干細胞的免疫表型標志，純度高。
【附圖說明】
[0016] 下面將結合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步說明，附圖中：
[0017] 圖1為本發(fā)明實施例脂肪組織來源的間充質干細胞的擴增培養(yǎng)方法工藝流程圖；
[0018] 圖2為本發(fā)明實施例脂肪組織來源的間充質干細胞分離方法工藝流程圖；
[0019] 圖3為本發(fā)明實施例1與對比實施例1中的脂肪組織來源的間充質干細胞的生長 增殖曲線示意圖，其中，"包被組"為本發(fā)明實施例1獲得的脂肪組織來源的間充質干細胞 增殖曲線，"未包被培養(yǎng)"為對比實施例1獲得的脂肪組織來源的間充質干細胞增殖曲線；
[0020] 圖4為本發(fā)明實施例1與對比實施例1的脂肪組織來源的間充質干細胞的細胞周 期圖，其中，圖4a為實施例1中的細胞有絲分裂周期圖，圖4b為對比實施例1中的細胞有 絲分裂周期圖；
[0021] 圖5為本發(fā)明實施例1的脂肪組織來源的間充質干細胞免疫表型檢測結果；
[0022] 圖6a為本發(fā)明實施例1中的脂肪組織來源的間充質干細胞誘導前進行顯微圖；
[0023] 圖6b為本發(fā)明實施例1中的脂肪組織來源的間充質干細胞誘導分化為脂肪細胞 油紅-O染色顯微圖。
【具體實施方式】
[0024] 為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發(fā)明作進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不 用于限定本發(fā)明。
[0025] 本發(fā)明實施例提供了一種簡便、高效的脂肪組織來源的間充質干細胞的擴增培養(yǎng) 方法。本發(fā)明實施例脂肪組織來源的間充質干細胞的擴增培養(yǎng)方法步驟如圖1所示，其包 括如下步驟：
[0026] 步驟SOL配制含脂肪組織來源的間充質干細胞的重懸液：將分離的脂肪組織來 源的間充質干細胞用脂肪干細胞培養(yǎng)基進行重懸處理，得到含脂肪組織來源的間充質干細 胞的重懸液；
[0027] 步驟S02.將重懸液接種至纖維粘連蛋白包被處理的干細胞培養(yǎng)器中進行擴增培 養(yǎng)：將步驟SOl中配制的重懸液接種至纖維粘連蛋白包被處理的干細胞培養(yǎng)器中進行擴增 培養(yǎng)；擴增培養(yǎng)24小時后更換所述脂肪干細胞培養(yǎng)基，之后每兩天更換所述脂肪干細胞培 養(yǎng)基一次，待生長融合至80-90%時，用胰酶消化處理后進行傳代培養(yǎng)。
[0028] 具體地，上述步驟SOl和步驟S02中的脂肪干細胞培養(yǎng)基含有如下組分：
[0029] 胎牛血清 0· l-10v/v%
[0030] 慶大霉素 l-10v/v%
[0031] 高糖 DMEM 培養(yǎng)基 80-98. 9v/v %。
[0032] 本發(fā)明實施例脂肪組織來源的間充質干細胞的擴增培養(yǎng)方法通過控制脂肪干細 胞培養(yǎng)基的組分實現脂肪組織來源的間充質干細胞的簡便、高效的擴增。具體地，低濃度胎 牛血清組分能夠有效抑制脂肪組織來源的間充質干細胞分化的同時可抑制非脂肪組織來 源的間充質干細胞特性細胞的增殖，高濃度慶大霉素對脂肪組織來源的間充質干細胞生長 無影響且能有效抑制非脂肪組織來源的間充質干細胞特性細胞的生長，而高糖DMEM培養(yǎng) 基能夠有效為脂肪組織來源的間充質干細胞擴增提供所需的營養(yǎng)成分。因此，在高糖DMEM 培養(yǎng)基的基礎上，通過添加胎牛血清和慶大霉素功能性成分，并調節(jié)兩者的含量，實現兩功 能性成分起到增效協同作用，從而實現脂肪組織來源的間充質干細胞高效的擴增。
[0033] 在一實施例中，在上述步驟SOl配制的含脂肪組織來源的間充質