一種快速分離乳腺癌原代腫瘤活細(xì)胞方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞分離技術(shù)領(lǐng)域，涉及乳腺癌原代腫瘤活細(xì)胞分離方法，尤其涉及高純度批量乳腺癌原代腫瘤活細(xì)胞快速分離方法。分離的乳腺癌原代腫瘤活細(xì)胞可用于藥敏試驗(yàn)。
【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)報(bào)道，目前國內(nèi)外對絕大多數(shù)的惡性腫瘤患者手術(shù)后采用化學(xué)藥物治療。而研究表明，化療只對其中約25%的腫瘤患者有效，對于化療無效的其余75%的患者來說，無疑是忍受了痛苦同時(shí)加重了對家庭以及社會(huì)的經(jīng)濟(jì)和精神雙重壓力。有研究表明，對那些化療藥物不敏感的乳腺癌細(xì)胞給予化療藥物的刺激，將促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的EMT和轉(zhuǎn)移，由此可見，耐藥的腫瘤細(xì)胞更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此，準(zhǔn)確的腫瘤藥敏試驗(yàn)對腫瘤尤其是乳腺癌的治療和預(yù)后的判斷顯得至關(guān)重要。
[0003]目前，現(xiàn)有技術(shù)的腫瘤藥敏試驗(yàn)中所采用的腫瘤單細(xì)胞分離技術(shù)是用膠原酶消化分離技術(shù)。實(shí)踐顯示，該種技術(shù)分離得到的單細(xì)胞在體外培養(yǎng)的前四周生長的大多數(shù)為腫瘤間質(zhì)中的非腫瘤細(xì)胞，即成纖維細(xì)胞，很難想像，用非腫瘤細(xì)胞為主的成纖維細(xì)胞為載體獲得的所謂腫瘤細(xì)胞藥敏試驗(yàn)的結(jié)果能在何種程度上準(zhǔn)確反映腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。事實(shí)上，目前臨床對腫瘤藥敏試驗(yàn)結(jié)果的反饋的確不如人意。鑒于此，國內(nèi)外業(yè)內(nèi)研究人員均試圖努力改進(jìn)腫瘤藥敏試驗(yàn)技術(shù)。本申請的發(fā)明人認(rèn)為，只有將高純度腫瘤細(xì)胞作為藥敏試驗(yàn)的載體，將有助于獲得腫瘤細(xì)胞對化療藥物敏感性的正確結(jié)果，并用以指導(dǎo)臨床正確選擇化療藥物進(jìn)行抗腫瘤治療。
[0004]以乳腺癌為例，腫瘤化療藥敏檢測通常采用體外與體內(nèi)兩類檢測方法。國內(nèi)外常用的體外藥敏試驗(yàn)檢測法有MTT法、CD-DST法和ATP-TCA法。但其中國內(nèi)業(yè)界常用MTT法已遭逐漸淘汰；日本目前常采用⑶-DST法；而歐美常采用ATP-生物熒光體外抗腫瘤藥物敏感性檢測技術(shù)(ATP-TCA法)。ATP-TCA法是近年來發(fā)展起來的較先進(jìn)的腫瘤藥敏檢測技術(shù)，臨床試驗(yàn)證實(shí)該技術(shù)的應(yīng)用提高了腫瘤的療效。美國國立衛(wèi)生研究院的GOG (GynecologicOncologyGroup)項(xiàng)目組認(rèn)為ATP-生物突光體外檢測腫瘤化療敏感性方法是最有發(fā)展前途的一種藥敏試驗(yàn)方法。該技術(shù)原理是根據(jù)細(xì)胞內(nèi)源性ATP含量與活細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)，測定細(xì)胞內(nèi)源性ATP的含量以反映細(xì)胞的活性和活細(xì)胞數(shù)量，在體外測定經(jīng)不同濃度化療藥物直接殺傷的培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞中的ATP含量，從而計(jì)算腫瘤細(xì)胞的抑制率，進(jìn)而判斷該腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感程度。
[0005]但是，該ATP-TCA法的前提是所檢測的細(xì)胞必須是高純度的乳腺癌腫瘤細(xì)胞，該技術(shù)中，只有對高純度的乳腺癌腫瘤細(xì)胞給予抗腫瘤藥物，才能真正檢測出該藥物對腫瘤細(xì)胞的直接殺傷作用，若這些用于做腫瘤藥物敏感性試驗(yàn)的細(xì)胞中除了腫瘤細(xì)胞外還含有其他對該藥物敏感的細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，那么在給藥時(shí)將有大量非腫瘤細(xì)胞被殺死，從而出現(xiàn)藥敏試驗(yàn)的假陽性或療效擴(kuò)大的結(jié)果。這對于個(gè)性化治療或預(yù)后的預(yù)測將會(huì)起到誤導(dǎo)的作用，甚至于出現(xiàn)過度治療的危害。
[0006]然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，乳腺癌腫瘤組織并不是單一種類的細(xì)胞樣本，而是多種細(xì)胞的混合體。在不同病例中腫瘤細(xì)胞的比例也存在很大差異:腫瘤細(xì)胞豐富者可以占組織中細(xì)胞總數(shù)的90%以上；而在某些病例中，腫瘤細(xì)胞數(shù)所占比例還不到腫瘤組織總細(xì)胞數(shù)的10%，其余多為間質(zhì)細(xì)胞，炎癥細(xì)胞，甚至于腫瘤組織中的正常上皮細(xì)胞等。倘若直接用手術(shù)切除組織做藥敏試驗(yàn)，非腫瘤細(xì)胞的存在將嚴(yán)重影響藥敏試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。由于腫瘤細(xì)胞系經(jīng)過體外長期培養(yǎng)后，生物學(xué)行為發(fā)生了改變，無法正確反應(yīng)化療藥物在體內(nèi)的反應(yīng)，并且不同的乳腺癌患者對化療藥物的反應(yīng)存在著個(gè)體差異性，因此，如果用已經(jīng)建系的乳腺癌細(xì)胞作為藥敏試驗(yàn)的載體，會(huì)出現(xiàn)與臨床用藥的結(jié)果相去甚遠(yuǎn)的情形，因此利用細(xì)胞系作為化療藥物的載體是不合適的。
[0007]目前國內(nèi)外現(xiàn)有技術(shù)的乳腺癌腫瘤細(xì)胞分離技術(shù)方法和藥敏體系均存在或多或少的缺點(diǎn)，無法快速批量分離高純度的原代腫瘤細(xì)胞。如:傳統(tǒng)酶消化法獲取的單細(xì)胞多為成纖維細(xì)胞，尤其在原代分離的前4周內(nèi)成纖維細(xì)胞作為優(yōu)勢細(xì)胞會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的生長，以這些細(xì)胞作為抗腫瘤藥物的靶細(xì)胞則會(huì)造成藥敏試驗(yàn)結(jié)果的假陽性；若采取多次傳代后在成纖維細(xì)胞中挑取腫瘤細(xì)胞克隆的方法，則需要消耗3-4周的時(shí)間，無法滿足臨床快速診斷的要求；且因長時(shí)間體外培養(yǎng)后可能改變腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，從而影響化療藥物的響應(yīng)程度；顯微切割技術(shù)(Lasercapturemicrodissect1n, LCM)是利用激光能量從組織切片或細(xì)胞培養(yǎng)皿中捕獲感興趣的細(xì)胞，雖然LCM可以快速準(zhǔn)確地從組織中捕獲目的細(xì)胞，但捕獲過程中激光的能量會(huì)破壞RNA的完整性，且每次操作時(shí)所能捕獲的細(xì)胞量也十分有限，不利于后續(xù)非擴(kuò)增性實(shí)驗(yàn)的開展；此外，LCM技術(shù)也無法直接捕獲組織中的活細(xì)胞。因此，在藥敏試驗(yàn)的細(xì)胞準(zhǔn)備中無法運(yùn)用LCM等上述方法和技術(shù)獲取靶細(xì)胞。
[0008]本申請的發(fā)明人擬提供一種可以快速批量分離高純度的原代腫瘤活細(xì)胞的方法，既可以彌補(bǔ)LCM的不足，又可以用于臨床藥敏試驗(yàn)。
[0009]與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)有下述參考文獻(xiàn):
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0024]本發(fā)明的目的旨在克服現(xiàn)有技術(shù)中存在缺陷，提供一種乳腺癌原代腫瘤活細(xì)胞分離方法，尤其是高純度批量乳腺癌原代腫瘤活細(xì)胞快速分離方法。本方法分離的乳腺癌原代腫瘤活細(xì)胞可用于藥敏試驗(yàn)。
[0025]本發(fā)明針對目前生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，原代乳腺癌細(xì)胞分離純度低且