物4:5，-TTCAGAATCCCAAATCTAATAAGGAA-3，(SEQ ID NO: 11)
[0054]TaASG033-3 基因的 RT-PCR 引物為:
[0055]引物5:5’-CGAAGCACCCAGCAGAAGG-3’ (SEQ ID NO: 12)
[0056]引物6:5，-CAAATTTCAGAATCCCAAATCTAATT-3，(SEQ ID NO: 13)
[0057]實施例3.TaASG033-l、TaASG033_2和TaASG033_3基因啟動子序列的獲得和順式元件分析
[0058]從TaASG033-l、TaASG033_2 和 TaASG033_3 基因的 cDNA 序列出發(fā)，利用 CerealsDB和 IWGSC (Internat1nal Wheat Genome Sequencing Consortium)公布的普通小麥的測序信息，以及2013年Nature上發(fā)表的小麥祖先烏拉爾圖小麥(Triticum urartu, A基因組供體)和粗山羊草(Aegilops tauschii，D基因組供體)的測序信息進行電子克隆，獲得了 TaASG033-l、TaASG033-2和TaASG033_3基因的啟動子，分別命名為TaASG033_l啟動子、TaASG033-2啟動子和TaASG033_3啟動子，其長度分別為2092bp、1997bp和2000bp，序列分別如 SEQ ID NO:5, SEQ ID N0:6 和 SEQ ID N0:7 所示。
[0059]利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫和PLACE數(shù)據(jù)庫，對TaASG033_l啟動子、TaASG033_2啟動子和TaASG033-3啟動子進行順式元件分析。如圖3所示，翻譯起始位點ATG用粗體下劃線表示，以翻譯起始位點ATG的A定義為“+I ”，AGAAA基序用陰影表示，GTGA基序用方框表示。TaASG033-l啟動子中有7個AGAAA基序、4個GTGA基序和I個AGGTCA基序，TaASG033_2啟動子中有6個AGAAA基序和8個GTGA基序，TaASG033_3啟動子中有6個AGAAA基序、4個GTGA基序和I個AGGTCA基序。AGAAA基序、GTGA基序和AGGTCA基序是與花粉/花藥特異表達相關的順式調(diào)控元件，TaASG033-l啟動子、TaASG033_2啟動子和TaASG033_3啟動子中多個AGAAA基序、GTGA基序和AGGTCA基序的存在表明該啟動子可能是與花粉/花藥特異表達有關的啟動子。
[0060]實施例4.TaASG033-3啟動子的克隆和植物表達載體的構(gòu)建
[0061 ] 將植物表達載體pBI 121用限制性內(nèi)切酶Hindi 11和EcoRI雙酶切，得到的35S:⑶S片段用T4DNA Iigase連入同樣用HindIII和EcoRI雙酶切的CAMBIA公司的PCAMBIA2300載體，新的載體被命名為p230035S:⑶S。
[0062]從TaASG033_3啟動子的5’端和ATG上游設計引物:
[0063]引物7:5，-aagctt CACAAATATAGTTTATTAGTCTTTTGGGAATG-3，(SEQ ID NO: 14)
[0064]引物8:5’ -actagt GGGGGAGAATGAGGCTAGAAG-3’ (SEQ ID NO: 15)
[0065]引物7中序列aagctt是HindIII的酶切位點，引物8中序列actagt是SpeI的酶切位點。
[0066]以小麥的基因組DNA為模板，用引物7和引物8進行擴增，反應條件是:94°C預變性5分鐘；94°C變性30秒；60°C退火30秒；72°C延伸2分30秒；35個循環(huán)；72°C延伸10分鐘。反應結(jié)束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收，產(chǎn)物連入pEASY-Blunt-Zero載體中，篩選陽性克隆并進行測序驗證，序列如SEQ ID勵:7所示，該質(zhì)粒稱為？239。
[0067]用限制性內(nèi)切酶Hindi和SpeI雙酶切p239，得到的TaASG033_3啟動子用T4DNAIigase連入用Hindi和XbaI雙酶切的p230035S:⑶S載體，得到植物表達載體p240，該質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)如圖4所示。
[0068]實施例5.農(nóng)桿菌介導的水稻遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定
[0069]利用熱激法將植物表達載體p240轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGLO菌株。
[0070]用農(nóng)桿菌侵染水稻胚性愈傷，暗中共培養(yǎng)2-3天，然后經(jīng)過兩步抗性篩選、預分化、分化和生根培養(yǎng)等步驟，最終獲得具有卡那霉素抗性的、轉(zhuǎn)P240水稻TO代植株。
[0071]設計引物對轉(zhuǎn)基因水稻植株進行PCR鑒定。
[0072]引物9:5，-CCACATCATCGGACACCCAC-3，(SEQ ID NO: 16)
[0073]引物10:5，-GCCGTCGAGTTTTTTGATTTCAC-3，(SEQ ID NO: 17)
[0074]反應條件為:94°C預變性5分鐘；94°C變性30秒；55°C退火30秒；72°C延伸I分30秒；30個循環(huán)；72°C延伸10分鐘。擴增的是TaASG033-3啟動子和⑶S的部分片段，長度為1430bp。鑒定結(jié)果表明，利用農(nóng)桿菌介導的水稻轉(zhuǎn)化獲得的抗性再生植株是轉(zhuǎn)p240基因的陽性植株。
[0075]實施例6.轉(zhuǎn)基因水稻植株不同組織器官⑶S基因表達的組織化學檢測
[0076]X-Gluc 母液:10mg X-Gluc 溶于 5ml DMF。
[0077]X-Gluc 基液:50mM PBS ρΗ7.0，1mM EDTA.2Na，0.1 % Triton X-100，5mM 鐵氫化鉀，0.5mM亞鐵氫化鉀。
[0078]X-Gluc 使用液:50 μ I 母液 +950 μ I 基液。
[0079]選擇合適大小的帶有⑶S報告基因的轉(zhuǎn)基因幼苗或特定組織浸入⑶S染液中，37°C染色過夜，吸去反應液，乙醇梯度脫色，顯微鏡觀察照相。
[0080]對P240轉(zhuǎn)基因水稻植株各組織器官的⑶S染色結(jié)果如圖5，在轉(zhuǎn)基因水稻的根、莖和葉等營養(yǎng)器官中都檢測不到GUS基因的表達(圖5A-C)，在花粉處于減數(shù)分裂期、單核期的花和花粉處于雙核期和三核期的除花藥以外的其它花器官中也檢測不到GUS基因的表達，TaASG033-3啟動子只能啟動⑶S基因在花粉處于雙核期和三核期的花藥中表達(圖OT-G)，說明TaASG033-3啟動子是一個花粉發(fā)育晚期花藥特異表達的啟動子。進一步，花粉處于雙核期的花藥壁中檢測不到GUS的表達(圖5H)，而雙核期和三核期的花粉中能夠檢測到⑶S的表達(圖51-J)，因此，TaASG033-3啟動子是一個小麥花粉發(fā)育晚期特異表達的啟動子。
【主權(quán)項】
1.一種啟動子，具有花藥特異表達的特性，其特征在于所述啟動子的核苷酸序列選自下列組的序列之一: Ca)具有SEQ ID NO:5、6或7所示的序列； (b)在嚴格條件下能夠與(a)所述序列的DNA雜交的DNA序列； (c)包含SEQID NO:5、6或7中至少100個連續(xù)核苷酸的DNA序列；和 (d)與(a)- (c)之任一所述序列互補的DNA序列。2.一種表達盒，具有在花藥中特異表達的特性，其特征在于所述表達盒包含權(quán)利要求1所述的啟動子序列。3.—種表達載體，其特征在于所述表達載體包含權(quán)利要求2所述的表達盒。4.一種工程菌，其特征在于所述工程菌含有權(quán)利要求3所述的表達載體。5.—種在植物中表達目的核苷酸序列的方法，所述方法包括向植物體導入DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體含有啟動子及操作性連接于所述啟動子的目的核苷酸序列，其中所述啟動子的核苷酸序列選自下列組的序列之一: Ca)具有SEQ ID NO:5、6或7所示的序列； (b)在嚴格條件下能夠與(a)所述序列的DNA雜交的DNA序列； (c)包含SEQID NO:5、6或7中至少100個連續(xù)核苷酸的DNA序列；和 (d)與(a)- (c)之任一所述序列互補的DNA序列。6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的植物為單子葉植物，優(yōu)選為禾本科植物，更優(yōu)選的為水稻或小麥。7.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的目的核苷酸序列可以是結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因、結(jié)構(gòu)基因的反義基因、調(diào)節(jié)基因的反義基因或者能夠干擾內(nèi)源基因表達的小RNA，其在花粉發(fā)育晚期的特異性表達可以調(diào)節(jié)花粉的育性及花粉萌發(fā)。8.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的目的核苷酸序列可以是編碼促使碳水化合物降解的酶或修飾酶、淀粉酶、脫支酶和果膠酶，更具體的如玉米a淀粉酶基因、生長素，rotB、細胞毒素基因、白喉毒素、DAM甲基化酶、親和素，或者可選自原核調(diào)控系統(tǒng)，還可以是顯性的雄性不育基因。9.權(quán)利要求1所述的啟動子在以下(a)至(d)中任一項中的應用: (a)培育植物品種或品系； (b)培育授粉受精能力增強植物品種或品系； (C)培育授粉受精能力消弱的植物品種或品系； Cd)培育雄性不育植物品種或品系。10.權(quán)利要求9所述的應用，其特征在于，所述的植物為單子葉植物，所述單子葉植物優(yōu)選為禾本科植物，更具體的，所述禾本科植物優(yōu)選為水稻或小麥。
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物生物技術領域，具體涉及植物花藥特異表達啟動子的分離和功能鑒定及應用。本發(fā)明所公開的啟動子在植物的花藥中特異表達，在植物轉(zhuǎn)基因領域具有很好的應用前景。
【IPC分類】C12N15/63, C12N15/82, C12N1/21, C12N15/113, A01H5/00
【公開號】CN104975025
【申請?zhí)枴緾N201510166122
【發(fā)明人】馬力耕, 李健, 鄧興旺
【申請人】未名興旺系統(tǒng)作物設計前沿實驗室（北京）有限公司, 興旺投資有限公司, 河北博農(nóng)農(nóng)業(yè)技術開發(fā)有限公司
【公開日】2015年10月14日
【申請日】2015年4月9日