一種富馬酸的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明涉及富馬酸的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 富馬酸(又稱延胡索酸）作為一種重要的四碳平臺化合物，在醫(yī)藥、食品以及表面 活性劑等行業(yè)有著廣泛的用途，可以通過酶催化轉(zhuǎn)化、酯化、加氫等工藝生產(chǎn)L-天冬氨酸、 蘋果酸、琥珀酸、馬來酸、1，4-丁二醇、Y-丁內(nèi)酯和四氫呋喃等四碳化合物。目前富馬酸主 要通過順丁烯二酸酐異構(gòu)化和糠醛氧化法生產(chǎn)，化學合成富馬酸因成本高和環(huán)境污染等原 因使得富馬酸作為基本化工原料的廣泛應用受到限制。
[0003] 富馬酸的生物合成法具體包括酶催化轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法。20世紀90年代中 期出現(xiàn)的酶催化轉(zhuǎn)化法一般都是以馬來酸為底物，在馬來酸異構(gòu)酶作用下制備富馬酸，但 原料馬來酸供應不足，且價格昂貴。20世紀70年代石油危機的出現(xiàn)，使得人們加大了對微 生物發(fā)酵法制備富馬酸的研究力度，這一時期人們用來發(fā)酵制備富馬酸的微生物有霉菌、 酵母及細菌。其中根霉菌Rhizopus為重點研究的對象，具體包括米根霉Rhizopus oryzae、 少根根霉Rhizopusarrhizus以及黑根霉Rhizopusnigricans等。在這一時期，我國科學 家對微生物發(fā)酵法生產(chǎn)富馬酸的研究工作也進行了一定的探索，其中山西微生物研究所的 白照熙等篩選出了具有產(chǎn)富馬酸能力的少根根霉，當振蕩培養(yǎng)于含有12%葡萄糖的培養(yǎng)基 時，富馬酸產(chǎn)量為53. 15g/L，得率為45%，同時產(chǎn)生了較多的副產(chǎn)物如蘋果酸等，但發(fā)酵周 期較長，需要11天左右（食品與發(fā)酵工業(yè)，1988,4:32~36)。美國Purdue大學的Tsao教 授等利用米根霉發(fā)酵產(chǎn)富馬酸，98g/L初始葡萄糖發(fā)酵48h，其富馬酸產(chǎn)量為33g/L，得率為 33.7% (Bioprocess Biosyst Eng, 2002,25:179 ~181)。
[0004] 發(fā)酵法生產(chǎn)富馬酸可以利用可再生資源和二氧化碳，不僅擺脫了對石化原料的依 賴，而且開辟了溫室氣體二氧化碳利用的新途徑。因此，以微生物發(fā)酵法生產(chǎn)富馬酸的研究 與開發(fā)正在美國、日本等國家深入地進行著。但霉菌生長速度慢，產(chǎn)品生產(chǎn)強度偏低。開發(fā) 對營養(yǎng)條件需求簡單、生長迅速、收率高的C4有機酸生產(chǎn)菌株是加速生物法替代石化法生 產(chǎn)的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是在產(chǎn)丁二酸重組大腸桿菌發(fā)酵結(jié)束時，通過一種溫 和、高效的方法回收菌體細胞，將回收菌體的細胞最終能夠轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基中以丁二酸鈉 為原料轉(zhuǎn)化合成富馬酸。
[0006] 為實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0007] (1)利用重組大腸桿菌采用兩階段發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸；
[0008] (2) 丁二酸發(fā)酵結(jié)束時，采用沉降法收集菌體回收細胞回收低活性的產(chǎn)丁二酸重 組大腸桿菌細胞；
[0009] (3)將回收低活性的產(chǎn)丁二酸重組大腸桿菌細胞，轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基中，通空氣或者 氧氣，并維持40%~60%的溶氧，溫度及發(fā)酵液pH值分別控制在33 °C~36 °C和6. 8~7. 5， 以丁二酸鈉為底物有氧轉(zhuǎn)化合成富馬酸，所述的新鮮培養(yǎng)基為JSM-CN培養(yǎng)基、JSM-CP培養(yǎng) 基、JSM-CT培養(yǎng)基。
[0010] 所述的步驟（1)具體操作為：用活化重組大腸桿菌菌體，轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基，添加 葡萄糖至初始濃度為20-30g · Γ1，培養(yǎng)過程溶氧維持在40%~60%以上；待葡萄糖基本消 耗完時改通CO2氣體，進入?yún)捬醢l(fā)酵產(chǎn)酸階段，發(fā)酵過程中補加葡萄糖的方法，且控制葡萄 糖濃度在5~20g · Γ1，同時添加用于提供二氧化碳供體，調(diào)控pH值在6. 8-7. 0之間。 [0011] 所述的活化重組大腸桿菌菌體為從甘油凍存管中取少量菌液，在LB平板上劃線 后放置于37°C下培養(yǎng)12h ;從LB平板上取單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基，在37°C，200r/min 條件下至菌體密度的0D600值在0. 6~0. 8之間。
[0012] 所述的步驟（2)具體操作為待發(fā)酵結(jié)束時，發(fā)酵罐內(nèi)停止通氣與攪拌，靜置5~10 分鐘，待細胞沉降完全后，將菌體細胞上層的發(fā)酵清液通過壓縮空氣給罐子增壓通過壓差 將發(fā)酵罐內(nèi)的上層清液移除；或者在發(fā)酵罐外面用泵將發(fā)酵罐內(nèi)的上層清液抽出發(fā)酵罐即 可實現(xiàn)菌體的收集。
[0013] 本發(fā)明利用重組大腸桿菌兩階段發(fā)酵(先進行有氧發(fā)酵再轉(zhuǎn)入?yún)捬跚闆r下進行發(fā) 酵）產(chǎn)丁二酸以后，將菌體進行回收，將原先菌體處于的厭氧狀態(tài)恢復至有氧狀態(tài)，讓菌體 重新恢復生長的能力，再以丁二酸鈉為原料來發(fā)酵制備富馬酸，而這種大腸桿菌經(jīng)兩階段 發(fā)酵以后再經(jīng)過有氧誘導菌體使其恢復生長，再以一定的原料進行發(fā)酵生產(chǎn)其他產(chǎn)物的方 法目前未見公開，而這種應用將有效提高產(chǎn)丁二酸重組大腸桿菌的利用效率。
[0014] 在大腸桿菌在厭氧的情況下菌體基本上是不生長的一個狀態(tài)，而本發(fā)明在厭氧發(fā) 酵結(jié)束時又將它恢復成好氧的狀態(tài)，使得菌體又恢復了生長的能力，同時菌體內(nèi)部的酶活 在一定培養(yǎng)基存在的情況下得到誘導，而富馬酸、丁二酸本身都是菌體進行三羧酸循環(huán)的 中間代謝產(chǎn)物，由于相關(guān)酶活得到了誘導，他們之間的互相轉(zhuǎn)化就變的成為可能。
[0015] 有益效果：
[0016] 本發(fā)明的技術(shù)方案，以回收的低活性的產(chǎn)丁二酸重組大腸桿菌為催化劑，丁二酸 鈉為底物，有氧轉(zhuǎn)化合成富馬酸，其轉(zhuǎn)化率達到92%以上。
[0017] 說明書附圖
[0018] 圖1為富馬酸生產(chǎn)過程曲線圖
【具體實施方式】
[0019] 本發(fā)明中所述的菌株及培養(yǎng)基：
[0020] 菌株：Escherichia coli AFPlll (Applied Environmental Microbiology. 2002, 68, 1715-1727)
[0021] 培養(yǎng)基：
[0022] (I) LB種子液培養(yǎng)基：酵母粉5g · Γ1 ;蛋白胨IOg · Γ1 ;NaC15g · Γ1 ;
[0023] (2 ) JSM 發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 40g · L-1 ;檸檬酸 3g · L-1 ;Na2HP04 · 7H203g · L-1 ; KH2P048g · L-1 ; (NH4) 2HP048g · L-1 ;NH4C10. 2g · I/1 ; (NH4)2SO4O. 75g · L-1 ; MgSO4 · 7H201. OOg · I/1 ;CaCl2 · 2H2010.0 mg · I/1 ;ZnS04 · 7H200. 5mg · I/1 ; CuCl2 · 2H200. 25mg · I/1 ;MnS04 · H202. 5mg · I/1 ;CoCl2 · 6H201. 75mg · I/1 ;H3B030. 12mg ; Al2 (SO4) 3 · xH2OL 77mg · L 1 ;Na2Mo04 · 2Η200· 5mg · L 1 ;梓樣酸鐵 16. Img · L 1 !VBjO · mg L 1 ; 生物素2mg · L'
[0024] 下面的實施例對本發(fā)明作詳細說明，但對本發(fā)明沒有限制。
[0025] 實施例1
[0026] 兩階段發(fā)酵產(chǎn)酸的過程采用如下技術(shù)方案中所描述的：
[0027] 菌種活化：從甘油凍存管中取少量菌液，在LB平板上劃線后放置于37°C下培養(yǎng) 12h ;種子液制備：從LB平板上取單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基，在37°C，200r/min條件下 搖瓶培養(yǎng)至菌體密度（〇D_)值0. 6。
[0028] 兩階段發(fā)酵：添加葡萄糖至初始濃度為25g · Γ1，培養(yǎng)過程溶氧維持在50% ;待葡 萄糖基本消耗完時改通CO2氣體，進入?yún)捬醢l(fā)酵產(chǎn)酸階段，發(fā)酵過程中采用恒速補加葡萄糖 的方法，且控