一種利用發(fā)酵檸檬酸廢菌絲體制備甲殼低聚糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用發(fā)酵檸檬酸廢菌絲體制備甲殼低聚糖的方法，屬于生物工程和環(huán)境科學(xué)的交叉技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]幾丁質(zhì)是2-乙酰氨基-2-脫氧-D-吡喃葡萄糖和2-氨基-2-脫氧-D-吡喃葡萄糖通過(guò)β_(1，4)糖苷鍵連接的二元線(xiàn)性共聚物，每年生物合成的資源量高達(dá)100億噸，是地球上僅次于植物纖維素的第二大生物資源。殼聚糖是幾丁質(zhì)脫乙?；漠a(chǎn)物，是一種天然的陽(yáng)離子高分子多糖，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、材料合成、化工、食品、化妝品及環(huán)保等諸多領(lǐng)域。盡管幾丁質(zhì)和殼聚糖的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)展，但其較差的溶解性仍然嚴(yán)重限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。和大分子相比，甲殼低聚糖無(wú)毒，易被人體吸收，并具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、抗菌、降膽固醇、保濕及促進(jìn)植物抗逆生長(zhǎng)等多種生理功能，在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景，成為近年來(lái)的研宄熱點(diǎn)。
[0003]目前幾丁質(zhì)主要從蝦、蟹殼中得到，但蝦、蟹產(chǎn)量不穩(wěn)定，難以收集、保鮮和運(yùn)輸；原料來(lái)源具有多樣化、差異性，品質(zhì)難以控制，使幾丁質(zhì)和幾丁質(zhì)的生產(chǎn)受到限制。微生物是幾丁質(zhì)和殼聚糖生產(chǎn)的又一重要的原料來(lái)源，幾丁質(zhì)在子囊菌綱、擔(dān)子菌綱、藻類(lèi)綱及半知菌綱等真菌細(xì)胞壁中的含量是十分可觀的(幾丁質(zhì)含量為菌絲干重的20% -22% )。與蝦、蟹殼相比，從真菌細(xì)胞壁中制取殼聚糖有許多優(yōu)點(diǎn)。例如，大部分真菌可通過(guò)工業(yè)發(fā)酵技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)，不受原料復(fù)雜性、季節(jié)性、地域性等的限制，產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量易于控制，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，周期短，動(dòng)力消耗和環(huán)境污染小。另外，發(fā)酵行業(yè)生產(chǎn)抗生素、酸后產(chǎn)生大量廢渣，據(jù)調(diào)查國(guó)內(nèi)每年產(chǎn)生的廢青霉素菌絲體就達(dá)幾十萬(wàn)噸，數(shù)量之大給廢料處理造成了極大困難。黑曲霉是發(fā)酵工業(yè)最常用的真菌，也是含有幾丁質(zhì)最多的真菌，我國(guó)檸檬酸產(chǎn)量達(dá)50萬(wàn)噸，產(chǎn)黑曲霉干菌體8萬(wàn)多噸，可從中提取到約1.6萬(wàn)多噸的幾丁質(zhì)，其產(chǎn)量十分驚人，因此利用檸檬酸工廠廢菌體中提取幾丁質(zhì)不僅可降低殼聚糖的成本，而且為綜合利用發(fā)酵廢渣提供了一條新途徑。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前國(guó)內(nèi)利用檸檬酸廠廢菌絲體提取幾丁質(zhì)和殼聚糖大多采用酸堿法，該法工藝簡(jiǎn)單，操作方便，但會(huì)給環(huán)境帶來(lái)很大污染且樣品純度及得率都很低。而采用生物法可大大減少環(huán)境污染，同時(shí)顯著提高產(chǎn)品的質(zhì)量與產(chǎn)率，故利用檸檬酸工廠廢菌絲體生物法提取甲殼低聚糖有很好的應(yīng)用前景。蔡駿等采用生物法利用檸檬酸發(fā)酵工廠廢菌絲體制備殼聚糖，避免了酸堿法給環(huán)境帶來(lái)的污染，分別選擇蝸牛酶和溶菌酶、中性蛋白酶和幾丁質(zhì)脫乙酰酶來(lái)破碎細(xì)胞、脫蛋白及脫乙?；?，使黑曲霉細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為殼聚糖。但細(xì)胞壁的主要組成成分是(1，3)-β-D-葡聚糖和一些(1，6)-β-D-葡聚糖連接的側(cè)鏈，在幾丁質(zhì)鏈的還原性末端的N-乙酰氨基葡萄糖通過(guò)(1，4)_或(1，2)-連接到側(cè)鏈的葡萄糖單元上。所以，很難得到純凈的幾丁質(zhì)，但可以采用專(zhuān)一性強(qiáng)的幾丁質(zhì)酶直接降解幾丁質(zhì)，得到甲殼低聚糖，并且避免使用多種酶。由于甲殼低聚糖具有較好的生物活性，該方法不僅為綜合利用青霉素、檸檬酸發(fā)酵工廠廢渣開(kāi)辟新的途徑，而且可生產(chǎn)甲殼低聚糖，所以具有非常廣闊的前景，但目前采用生物法以廢菌絲體來(lái)制備甲殼低聚糖未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
[0004]本發(fā)明利用檸檬酸發(fā)酵工業(yè)的黑曲霉廢菌體，采用生物法處理廢菌體，通過(guò)預(yù)處理、細(xì)胞破碎、酶法破壁，采用幾丁質(zhì)酶與蝸牛酶結(jié)合降解得到甲殼低聚糖，探討提取方法和條件，并用紅外光譜等方法對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行化學(xué)表征與分析對(duì)比，確立優(yōu)化方法。該法制備甲殼低聚糖條件溫和，綜合利用工廠廢菌體，減少環(huán)境污染，且甲殼低聚糖具有許多重要的生物活性和生理功能，變廢為寶，降低原料成本，同時(shí)為再生資源的綜合利用提供理論依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種利用甲殼素酶降解發(fā)酵檸檬酸的廢菌絲體制備甲殼低聚糖的方法，以檸檬酸發(fā)酵廢棄菌絲體為原料，利用酶制劑進(jìn)行生物降解，過(guò)程中不涉及強(qiáng)酸強(qiáng)堿，無(wú)環(huán)境污染。處理后的廢棄菌絲體可以用于制備甲殼低聚糖，從而形成一條新的甲殼低聚糖制備方法。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人通過(guò)大量試驗(yàn)反復(fù)研宄，最終獲得了如下工藝路線(xiàn):
[0007]一種利用發(fā)酵檸檬酸廢菌絲體制備甲殼低聚糖的方法，包括如下步驟:
[0008](I)將發(fā)酵檸檬酸的廢菌絲體用水沖洗，過(guò)濾，收集，然后將收集到的廢菌絲體晾干；
[0009](2)將晾干的廢菌絲體用0.3?0.6mol/L的酸、堿或鹽溶液浸泡，過(guò)濾，然后水洗廢菌絲體至濾液呈無(wú)色且pH ~ 7.0 ;
[0010](3)將步驟⑵處理得到的廢菌絲體用甲殼素酶降解制備得到甲殼低聚糖溶液；
[0011](4)將甲殼低聚糖溶液通過(guò)HPLC檢測(cè)得到甲殼低聚糖。
[0012]所述步驟(3)中，將步驟(2)處理得到的廢菌絲體在甲殼素酶降解之前用蝸牛酶或纖維素酶酶解破壁。
[0013]所述的蝸牛酶或纖維素酶酶解破壁步驟，采用的酶解緩沖液為醋酸-醋酸鈉緩沖液，蝸牛酶或纖維素酶的用量為廢菌絲體的4wt %，酶解溫度為50°C，pH為5.6，酶解時(shí)間為4小時(shí)。
[0014]所述步驟(3)中，在甲殼素酶降解的同時(shí)加入滅活的蝸牛酶輔助降解。
[0015]步驟⑴中采用60目篩網(wǎng)過(guò)濾、300目篩網(wǎng)收集廢菌絲體。
[0016]步驟⑵中將晾干的廢菌絲體用0.5mol/L的NaOH溶液浸泡8小時(shí)。
[0017]步驟(3)所述的甲殼素酶為基因重組蛋白，其制備方法為:重組大腸桿菌經(jīng)誘導(dǎo)、表達(dá)，然后經(jīng)破碎、分離、純化獲得重組甲殼素酶。
[0018]所述的甲殼素酶用量為廢菌絲體的0.3wt%。
[0019]步驟(3)所述的甲殼素酶降解，降解溫度37°C，降解pH為7.0-8.0，降解時(shí)間為4天，采用的酶解緩沖液為醋酸-醋酸鈉緩沖液。
[0020]制備得到的甲殼低聚糖為乙酰氨基葡萄糖和/或乙酰氨基葡萄糖二糖。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用檸檬酸發(fā)酵后廢菌絲體制備甲殼低聚糖的方法所具有的創(chuàng)新點(diǎn)在于:
[0022]I)采用酶制劑進(jìn)行生物法處理檸檬酸發(fā)酵后廢棄物，既不同于現(xiàn)有的強(qiáng)酸強(qiáng)堿的方法對(duì)環(huán)境的危害，也不同于現(xiàn)有方法中指將廢棄物制備成甲殼素或殼聚糖，而是利用甲殼素酶降解廢菌絲體直接獲得甲殼低聚糖，其在成本和效率上具有更大優(yōu)勢(shì)。
[0023]2)采用了簡(jiǎn)單的三步法降解制備甲殼低聚糖，即:0.5mol/L NaOH浸泡、蝸牛酶酶法破壁和甲殼素酶降解，可直接獲得乙酰氨基葡萄糖與乙酰氨基葡萄糖二糖。其產(chǎn)物組分具有一定的穩(wěn)定性。
[0024]綜上，本發(fā)明利用酶法降解檸檬酸發(fā)酵廢棄物，一方面能夠降低發(fā)酵對(duì)環(huán)境的污染；另一方面，該發(fā)明可以利用廢棄物更簡(jiǎn)便的直接獲得甲殼低聚糖，并加少了酸堿的用量。
【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1為本發(fā)明利用檸檬酸發(fā)酵后廢菌絲體制備甲殼低聚糖的方法的路線(xiàn)圖。
【具體實(shí)施方式