用PBST緩沖液洗三次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育Ih，PBST緩沖液洗三次后，加入ECL超敏發(fā)光液，將PVDF膜進(jìn)行壓片、曝光、顯影及定影，圖像經(jīng)Image J軟件灰度掃描后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0007]我們首先使用單層細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)苦參堿對(duì)人胰腺癌細(xì)胞迀移的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)50 Pg/ml苦參堿作用細(xì)胞24h，顯著抑制了細(xì)胞迀移。然后，細(xì)胞浸潤(rùn)分析實(shí)驗(yàn)檢測(cè)苦參堿對(duì)細(xì)胞浸潤(rùn)的影響，結(jié)果表明，苦參堿作用顯著抑制了人胰腺癌細(xì)胞浸潤(rùn)能力。這些數(shù)據(jù)表明，苦參堿抑制了人胰腺癌細(xì)胞迀移與浸潤(rùn)，但具體機(jī)制不清楚。
[0008]苦參堿對(duì)細(xì)胞MT1-MMP，MMP2，MMP9表達(dá)的影響
為探討苦參堿抑制人胰腺癌細(xì)胞迀移的分子機(jī)制，我們首先檢測(cè)了細(xì)胞MTl-MMP的表達(dá)水平。RT-PCR檢測(cè)MTl-MMP表達(dá)，發(fā)現(xiàn)苦參堿處理組細(xì)胞MTl-MMP表達(dá)顯著降低。同時(shí)，我們接著檢測(cè)了 MTl-MMP及其下游效應(yīng)蛋白MMP2、MMP9的表達(dá)水平。免疫印跡分析結(jié)果表明，苦參堿作用顯著降低了 MTl-MMP蛋白表達(dá)水平。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)表明，苦參堿處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP2、MMP9表達(dá)水平明顯降低。
[0009]Wnt通路參與到苦參堿對(duì)MTl-MMP水平的調(diào)節(jié)作用
由于Wnt通路參與MTl-MMP基因表達(dá)調(diào)控，我們檢測(cè)了苦參堿對(duì)Wnt通路的調(diào)控。Western Blot結(jié)果表明苦參堿作用一定時(shí)間后，細(xì)胞Wnt，β-Catenin表達(dá)水平明顯降低，與MTl-MMP表達(dá)變化趨勢(shì)一致。這提示W(wǎng)nt通路可能參與對(duì)MTl-MMP表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。
[0010]苦參堿通過(guò)Wnt信號(hào)通路對(duì)MTl-MMP轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行調(diào)控
為檢測(cè)苦參堿對(duì)MTl-MMP轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)作用，我們使用了染色體免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)了 MTl-MMP轉(zhuǎn)錄活性與Wnt信號(hào)通路的關(guān)系。結(jié)果表明苦參堿作用后β -Catenin結(jié)合的MTl-MMP明顯減少，提示MTl-MMP轉(zhuǎn)錄水平下降與Wnt通路有關(guān)。
[0011]在許多腫瘤發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程中均伴隨著MTl-MMP異常表達(dá)。MTl-MMP誘導(dǎo)表達(dá)與Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。敲除β-catenin，細(xì)胞內(nèi)MTl-mmp表達(dá)水平顯著降低。前期研宄表明，苦參堿具有抑制腫瘤細(xì)胞迀移的作用，但具體機(jī)制不清楚。我們當(dāng)前的研宄第一次證明了苦參堿通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β -Catenin信號(hào)通路，下調(diào)MTl-MMP的表達(dá)水平，抑制細(xì)胞的迀移與浸潤(rùn)。
[0012]我們首先通過(guò)細(xì)胞劃痕及Trans Well實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了苦參堿對(duì)人胰腺癌細(xì)胞的迀移及浸潤(rùn)的影響。結(jié)果表明苦參堿作用細(xì)胞后，細(xì)胞迀移及浸潤(rùn)能力顯著下降。具有時(shí)間、濃度依賴(lài)性。
[0013]腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)于轉(zhuǎn)移是多步驟、多因素共同作用的過(guò)程，牽涉到多種復(fù)雜的機(jī)制與多條通路。許多蛋白分子參與細(xì)胞粘附、迀移及浸潤(rùn)行為的調(diào)節(jié)。細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白家族通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)成份(ECM)參與細(xì)胞迀移及浸潤(rùn)的調(diào)節(jié)。MTl-MMP (MMP-14)是與細(xì)胞迀移最密切的蛋白分子。然而，苦參堿抑制胰腺癌細(xì)胞迀移是否與MTl-MMP表達(dá)及Wnt通路調(diào)節(jié)有關(guān)，目前還未見(jiàn)報(bào)道。我們發(fā)現(xiàn)苦參堿作用細(xì)胞后，細(xì)胞MTl-MMP基因及蛋白表達(dá)水平均下降。細(xì)胞MMPs水平受到各種因素的精細(xì)調(diào)節(jié)。在轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后修飾中均受到嚴(yán)格調(diào)控。由于MTl-MMP的轉(zhuǎn)錄受到Wnt的調(diào)節(jié)，所以，我們進(jìn)一步檢測(cè)了苦參堿對(duì)Wnt通路與MTl-MMP表達(dá)的調(diào)節(jié)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Wnt通路變化趨勢(shì)與MTl-MMP轉(zhuǎn)錄水平一致?？鄥A作用細(xì)胞后，只能檢測(cè)到很低水平的MTl-MMP的轉(zhuǎn)錄活性。提示W(wǎng)nt通路參與了苦參堿抑制腫瘤細(xì)胞迀移的調(diào)控。
[0014]總之，我們當(dāng)前的研宄第一次證明了苦參堿在抑制胰腺癌細(xì)胞迀移和浸潤(rùn)中的作用，而且表明苦參堿是通過(guò)經(jīng)典fct信號(hào)通路調(diào)節(jié)了 MTl-MMP的表達(dá)。
[0015]上述實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的說(shuō)明，不是對(duì)本發(fā)明的限定，任何對(duì)本發(fā)明簡(jiǎn)單變換后的方案均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種苦參堿抑制人胰腺癌細(xì)胞迀移的分析方法，其特征在于:依次包括以下步驟: a)人胰腺癌細(xì)胞培養(yǎng):將人胰腺癌細(xì)胞培養(yǎng)于RPM1-1640培養(yǎng)基中，RPM1-1640培養(yǎng)基中含胎牛血清、生物活性為100 IU/mL的青霉素和生物活性為100 Pg/mL的鏈霉素，RPM1-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37° C，CO2體積濃度為5%培養(yǎng)箱中； b)單層細(xì)胞迀移分析:將人胰腺癌細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)24h，當(dāng)人胰腺癌細(xì)胞匯合度達(dá)90%以上時(shí)，用200 μ I無(wú)菌Tip槍頭固定一個(gè)角度進(jìn)行劃痕，然后使用無(wú)菌PBS洗去人胰腺癌細(xì)胞碎片，再加入新鮮的RPM1-1640培養(yǎng)基，其中一組不加入苦參堿作為空白組，藥物處理組分別加入濃度為25 μ g/ml、50 μ g/ml苦參堿作用24_48h，最后通過(guò)倒置相差顯微鏡跟拍攝細(xì)胞遷移能力； c)細(xì)胞浸潤(rùn)分析:將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胰腺癌細(xì)胞按4X 14密度接種于細(xì)胞浸潤(rùn)小室，細(xì)胞浸潤(rùn)小室上部為含有2% FBS的的RPM1-1640完全培養(yǎng)基，細(xì)胞浸潤(rùn)小室下部為含有10% FBS的RPM1-1640完全培養(yǎng)基，人胰腺癌細(xì)胞在培養(yǎng)箱中孵育2h后，分別加入濃度為0μ/πι1、25μ/πι1、50μ/πι1的苦參堿處理并在培養(yǎng)箱中孵育10h，然后加入多聚甲醛室溫固定15min，使用無(wú)菌PBS洗三次后加入0.2%結(jié)晶紫染lOmin，去離子水沖洗干凈后置于倒置顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析； d)酶聯(lián)免疫吸附分析:將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胰腺癌細(xì)胞按4X14密度接種于6孔板培養(yǎng)過(guò)夜后，分別加入濃度為O μ g/ml、25 μ g/ml、50 μ g/ml的苦參堿處理并在培養(yǎng)箱中孵育24h，將人胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行裂解處理，收集人胰腺癌細(xì)胞上清液，分別采用MMP-9 ELISA試劑盒、MMP-2 ELISA試劑盒來(lái)檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組中MMP-9和MMP-2的濃度； e)免疫印跡分析:收集人胰腺癌細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑Cocktail，在冰浴中裂解30min，離心機(jī)離心30min后收集上清，通過(guò)BCA法測(cè)蛋白濃度并均衡各組蛋白，同等量細(xì)胞總蛋白用于12% SDS-PAGE電泳，蛋白經(jīng)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)到PVDF膜，室溫下添加5%脫脂奶粉后封閉lh，然后加入兔抗人wnt、β -catenin,MTl-MMP,在4°C的溫度下孵育過(guò)夜，采用PBST緩沖液洗三次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育Ih，PBST緩沖液洗三次后，加入ECL超敏發(fā)光液，將PVDF膜進(jìn)行壓片、曝光、顯影及定影，圖像經(jīng)Image J軟件灰度掃描后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種苦參堿抑制人胰腺癌細(xì)胞遷移的分析方法，包括以下步驟：人胰腺癌細(xì)胞培養(yǎng)、單層細(xì)胞遷移分析、細(xì)胞浸潤(rùn)分析、酶聯(lián)免疫吸附分析和免疫印跡分析。采用本方法分析后能得知苦參堿作用一定時(shí)間能顯著降低人胰腺癌細(xì)胞的遷移與浸潤(rùn)能力，人胰腺癌細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白MT1-MMP及Wnt、β-Catenin表達(dá)明顯降低；進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MT1-MMP轉(zhuǎn)錄活性也顯著降低，與Wnt信號(hào)通路活性一致，苦參堿通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt通路活性，降低MT1-MMP的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，進(jìn)而抑制人胰腺癌細(xì)胞的遷移與浸潤(rùn)。
【IPC分類(lèi)】C12Q1/02
【公開(kāi)號(hào)】CN104975064
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510314756
【發(fā)明人】馬永超, 鄒發(fā)長(zhǎng), 劉曉東, 鄧同興, 萬(wàn)維, 史齊, 饒淑梅, 王建國(guó), 崔明辰
【申請(qǐng)人】漯河醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校
【公開(kāi)日】2015年10月14日
【申請(qǐng)日】2015年6月10日