血清ssc-miR-194b作為檢測(cè)仔豬腸道應(yīng)激損傷分子標(biāo)記物的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于家畜基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及血清SSC-miR-194b作為檢測(cè)仔豬 腸道應(yīng)激損傷分子標(biāo)記物的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 仔豬斷奶應(yīng)激是全世界生豬養(yǎng)殖中的一大難題，每年都給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì) 損失。應(yīng)激導(dǎo)致的仔豬腹瀉，更是目前養(yǎng)豬生產(chǎn)中最常見(jiàn)和危害性最大的一種應(yīng)激性疾 病。斷奶應(yīng)激主要的靶點(diǎn)是仔豬的胃腸道，其中對(duì)小腸的損傷尤為嚴(yán)重。斷奶應(yīng)激引發(fā)的 仔豬小腸組織損傷和重建嚴(yán)重影響了仔豬腸道的發(fā)育和成熟，從而制約了仔豬的健康和生 長(zhǎng)。同樣，斷奶應(yīng)激引發(fā)腸道損傷致使胃腸酶合成和吸收能力的下降被認(rèn)為是斷奶仔豬腹 瀉的原發(fā)性因素（伍曉雄，1999);腸黏膜受損是導(dǎo)致仔豬腹瀉的主要原因之一（嚴(yán)宏祥等， 2006)。故斷奶期被認(rèn)為是腸道發(fā)育的一個(gè)重要時(shí)期，在這個(gè)時(shí)期由于仔豬的腸道尚未發(fā)育 成熟，斷奶應(yīng)激有可能對(duì)仔豬腸道健康造成終生影響（Smith et al，2010)。
[0003] 目前，腸道受損最有力的直接證據(jù)是將仔豬屠宰后進(jìn)行腸粘膜形態(tài)學(xué)變化的檢 測(cè)。腸絨毛高度的降低和隱窩深度的增加是研宄報(bào)道中證實(shí)腸粘膜結(jié)構(gòu)受損的一項(xiàng)最主要 的指標(biāo)（Nabuurs等，1993)。然而，屠宰破壞性的研宄只能用于研宄機(jī)理的闡述。若能通 過(guò)非屠宰的方式，例如在血液中發(fā)現(xiàn)可靠的反映腸道應(yīng)激損傷的指標(biāo)，對(duì)于盡早預(yù)防、診斷 和治療腸道應(yīng)激損傷、提高養(yǎng)豬生產(chǎn)性能、增加養(yǎng)豬經(jīng)濟(jì)效益，以及特別是將其作為分子標(biāo) 記物應(yīng)用于豬分子育種中提高生豬整體健康水平，均具有非常重要的生產(chǎn)實(shí)踐意義和科學(xué) 意義。因此，科學(xué)家們對(duì)斷奶仔豬血清/血漿中二胺氧化酶（DAO)活性、D-乳酸含量和皮 質(zhì)醇含量等的變化進(jìn)行了相關(guān)研宄（錢仲倉(cāng)等，2009 ;鐘武裝等，2013 ;胡彩虹等，2013 ;黃 其春等，2014 ;Wolvekamp等，1994 ;黎君友等，2000 ;胡泉舟，2007)。但上述指標(biāo)變化的檢 測(cè)均為相對(duì)值，要求有相應(yīng)對(duì)照樣品做參比并通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析才能得出結(jié) 論，因此不具備診斷價(jià)值。
[0004] 血清/血衆(zhòng)miRNAs的發(fā)現(xiàn)無(wú)疑是miRNAs研宄領(lǐng)域中的一項(xiàng)重大突破，為miRNAs 在動(dòng)物上的研宄提供了新的研宄思路?，F(xiàn)有研宄證實(shí)血清miRNAs不僅存在且具有廣泛性、 穩(wěn)定性和特異性，特別是具有無(wú)創(chuàng)性和便捷性等無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)。此外，它的變化與機(jī)體的 生長(zhǎng)發(fā)育、疾病發(fā)生發(fā)展和應(yīng)激等多種生理現(xiàn)象密切相關(guān)。Mitchell等（2008)首先在腫瘤 患者血衆(zhòng)中證實(shí)了 miRNAs的存在。幾乎同時(shí)，Chen等又在健康人類、肺癌、結(jié)腸癌和糖尿病 等疾病患者以及包括鼠、牛和馬等動(dòng)物血清和血漿中檢測(cè)到了多種miRNAs，并證實(shí)miRNAs 在血清和血漿中無(wú)顯著差異、且其含量幾乎不受室溫、高溫、pH、多次凍融的影響。Gilad等 (2008)通過(guò)比較妊娠婦女血清、尿液、唾液、羊水和胸膜液中的miRNAs，認(rèn)為血清miRNAs更 適合作為一種新型生物標(biāo)記物。Blondal等（2013)指出當(dāng)機(jī)體發(fā)生病理變化時(shí)，miRNAs可 快速?gòu)慕M織釋放到體液。提示血清循環(huán)miRNAs具有及時(shí)、特異性反映機(jī)體生理狀態(tài)的優(yōu) 勢(shì)。已有報(bào)道表明血清/血漿miRNAs的檢測(cè)有助于診斷組織器官損傷（Redell等，2010)、 關(guān)節(jié)炎（Murata等，2010)、心血管系統(tǒng)疾?。═i jsen等，2012)、肝炎（Zhang等，2012)和 糖尿?。℅uay等，2013)等多種疾病，特別是在各種惡性腫瘤方面的研宄成果更為豐富（Liu 等，2013 ;Madhavan 等，2013 ;Sozzi 等，2014)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供血清SSc-miR-194b作為檢測(cè)仔豬腸道 應(yīng)激損傷分子標(biāo)記物的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 血清SSC-miR-194b作為檢測(cè)仔豬腸道應(yīng)激損傷分子標(biāo)記物的應(yīng)用，所述 ssc-miR-194b的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 進(jìn)一步地，所述ssc-miR-194b的反轉(zhuǎn)錄引物（莖-環(huán)引物）如SEQ ID NO. 2所示。
[0009] 進(jìn)一步地，所述ssc_miR-194b正向引物如SEQ ID NO. 3所不，ssc_miR-194b反向 引物如SEQ ID NO. 4所示。
[0010] 上述應(yīng)用包括以下步驟：
[0011] (1)收集斷奶仔豬全血，制備血清樣品；
[0012] (2)米用 Plasma/Serum Exosome Kit (Norgen，492〇0)試劑提取血清樣品中 total RNA ；
[0013] (3)米用 miRNeasy Mini Kit (Qiagen 217004)試劑盒提取 total RNA 中的血清中 小分子RNA ;
[0014] (4)采用如SEQ ID NO. 2所示的ssc-miR-194b反轉(zhuǎn)錄引物對(duì)小分子RNA進(jìn)行反 轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA :所述反轉(zhuǎn)錄體系為：小分子RNA樣品2. 5ul (40ng/ul)、ssc-miR-194b反 轉(zhuǎn)錄引物 〇.5ul(2uM)、dNTP 0.25ul(10mM each)、5XRT buffer 1.0 ul、RNase inhibitor 0. 25ul (40U/ul)、M-MLV 0. 5ul (200U/ul)，反應(yīng)體系總體積為5. Oul，將均勻混合的反應(yīng)體 系放置42°C反應(yīng)60min，再放置70°C反應(yīng)15min，4°C保存；
[0015] (5)以U6為內(nèi)參，采用ssc-miR-215的正向引物和反向引物對(duì)cDNA進(jìn)行熒光定 量 PCR;反應(yīng)體系為：步驟 4 得到的 cDNA 1.0ul、2XSYBR Green Mixl0.0ul、RNase_free Water 8.2ul、SEQ ID NO. 3 所示的 ssc-miR-215 正向引物 0· 4ul (IOuM)，SEQ ID NO. 4 所示 的ssc-miR-215反向引物0. 4ul (IOuM)，反應(yīng)體系總體積為20.0 ul ;熒光定量PCR反應(yīng)條 件：50°C反應(yīng) 2min、95°C反應(yīng) 5min ;然后 95°C反應(yīng) 15s、60°C反應(yīng) 15s，40cycles。
[0016] (6)熒光定量PCR結(jié)果Λ Ct值若為負(fù)值，則表明斷奶仔豬腸道應(yīng)激損傷；若熒光 定量PCR結(jié)果△ Ct值為正值，則表明斷奶仔豬腸道沒(méi)有發(fā)生應(yīng)激損傷。
[0017] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明填補(bǔ)了目前斷奶仔豬腸道應(yīng)激損傷診斷方法的 空白，提供了血清SSC-miR-194b作為檢測(cè)仔豬腸道應(yīng)激損傷分子標(biāo)記物的應(yīng)用。本發(fā) 明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明首次公開了采用血清ssc-miR-194b以及分別用于反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增SSC-miR-194b的莖一環(huán)引物和正向引物、內(nèi)參基因?yàn)閁6對(duì)斷奶仔豬的腸道應(yīng)激進(jìn)行診斷， 診斷結(jié)果ACt值結(jié)果若為負(fù)值，則表明斷奶仔豬腸道應(yīng)激損傷，ACt值為正值，則表明斷 奶仔豬腸道沒(méi)有發(fā)生應(yīng)激損傷。該標(biāo)記物的發(fā)掘和應(yīng)用為斷奶仔豬腸道應(yīng)激損傷的預(yù)防、 診斷和治療提供指導(dǎo)，特別是為豬抗應(yīng)激品系的標(biāo)記輔助選擇提供一個(gè)新的分子標(biāo)記物。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為3號(hào)仔豬空腸絨毛形態(tài)圖；
[0019] 圖2為5仔豬空腸絨毛形態(tài)圖；
[0020] 圖3為13號(hào)仔豬空腸絨毛形態(tài)圖；
[0021] 圖4為15仔豬空腸絨毛形態(tài)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 實(shí)施例1 :本實(shí)施例通過(guò)斷奶仔豬的血清microRNA和腸道m(xù)icroRNA相關(guān)性分析， 獲得ssc-miR-194b，包括以下步驟：
[0023] 1.仔豬腸道樣品總RNA提取
[0024] 從胎次及出生日期均相同的4窩、25日齡仔豬中選取24頭（每窩6頭）為研宄對(duì) 象，平均分為哺乳組和斷奶組（當(dāng)日斷奶）。分別在斷奶組仔豬斷奶后ld，4d和7d，每組各 屠宰仔豬4頭（每窩1頭）。收集空腸組織樣品，采用Trizol法提取仔豬腸道組織總RNA 樣品。
[0025] 2.小分子RNA文庫(kù)構(gòu)建
[0026] 將各處理組的4個(gè)生物學(xué)重復(fù)總RNA樣品按濃度折算后進(jìn)行等量混合分別形成 RNA樣品池，利用15%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳從總RNA樣品中分離20-30nt范圍內(nèi)的 小分子RNA，連接Y和:V接頭、純化，反轉(zhuǎn)錄為cDNA并經(jīng)PCR擴(kuò)增后形成測(cè)序文庫(kù)。純化 小分子RNA文庫(kù)，經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)合格后上機(jī)測(cè)序。本實(shí)驗(yàn)采用Illumina HiSeq2000測(cè)序平臺(tái) 的單端50bp測(cè)序模式完成樣品的高通量測(cè)序。測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)需去除引物和adaptor 序列，并經(jīng)過(guò)對(duì)測(cè)序片段堿基的質(zhì)量檢驗(yàn)和長(zhǎng)度篩選，最終選擇質(zhì)量可靠的測(cè)序片段。
[0027] 3.斷奶仔豬腸道差異表達(dá)miRNAs的分析
[0028] 將miRNAs表達(dá)量進(jìn)行歸一化后，對(duì)已鑒定的miRNAs進(jìn)行差異表達(dá)分析結(jié)果表明 (表1~表3):仔豬斷奶后Id組與其對(duì)照組相比，共發(fā)現(xiàn)16個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，其中11 個(gè)顯著上調(diào)，5個(gè)顯著下調(diào)；斷奶后4d組與其對(duì)照組相比，共發(fā)現(xiàn)98個(gè)差異表達(dá)的miRNAs， 其中92個(gè)顯著上調(diào)，6個(gè)顯著下調(diào)；斷奶后7d組與其對(duì)照組相比，共發(fā)現(xiàn)22個(gè)差異表達(dá)的 miRNAs，其中15個(gè)顯著上調(diào)，7個(gè)顯著下調(diào)。由上可見(jiàn)，斷奶應(yīng)激顯著影響了仔豬腸道組織 中miRNAs的表達(dá)，且在斷奶后4d影響最為顯著，另外miR-215和miR-194b在所有差異表 達(dá)的miRNAs中呈最大表達(dá)豐度、且均為少數(shù)下調(diào)miRNAs之一。因此，后續(xù)的microRNA芯 片和熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)主要是比較了仔豬斷奶后4日齡組及其對(duì)照組的差異。
[0029] 表1:斷奶后1日齡組
[0030]
[0031] 表2:斷奶后4日齡組
[0032]


[0035] 表3:斷奶后7日齡組
[0036]
[0037] 二、microRNA芯片獲得斷奶仔豬血清microRNA的差異表達(dá)譜