恙蟲病東方體TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測體系統(tǒng)及其檢測方法
【專利說明】恙蟲病東方體TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測體系 統(tǒng)及其檢測方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)檢測領(lǐng)域，特別涉及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法及其檢測體 系，適合于鼠類及恙螨等攜帶的恙蟲病東方體的核酸檢測工作。
【背景技術(shù)】
[0003] 蟲媒病是一類重要的傳染病。在我國每年傳染病總發(fā)病病例中約占5 %~10 %， 死亡病例數(shù)占傳染病總死亡數(shù)的30 %~40 %。近年來，全球新發(fā)現(xiàn)的30余種傳染病中，有 許多是由病媒生物傳播的。恙蟲?。═sutsugamushi Disease)又稱叢林斑瘆傷寒，是由恙 蟲病東方體（Oriewiia 引起的自然疫源性疾病，可引起高熱、發(fā)瘆等癥狀， 常可致死。
[0004] 在我國，近年來，恙蟲病病例時(shí)有發(fā)生。迄今為止，我國22個(gè)省區(qū)均有該病的發(fā)生 和流行，疫區(qū)不斷擴(kuò)大是當(dāng)前我國恙蟲病疫情的流行趨勢。恙蟲病東方體的主要媒介昆蟲 為恙螨，嚙齒動(dòng)物尤其是鼠類是其主要傳染源，恙蟲病東方體可長期在鼠類體內(nèi)保存，故感 染恙蟲病的鼠類具有較長的傳染期。
[0005] 鼠類是出入境交通工具中常見的媒介生物之一，可隨飛機(jī)、輪船等載體在國境口 岸之間擴(kuò)散。近年來，我國衛(wèi)生檢疫機(jī)構(gòu)在北京、上海、寧波、成都等口岸的入境飛機(jī)、輪船、 集裝箱中查獲大量的鼠類。鼠類的輸入對(duì)我國國境口岸衛(wèi)生安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。
[0006] 我國目前有港口、機(jī)場、車站及陸路邊境口岸約400個(gè)，每年均有大量媒介生物借 助交通工具、集裝箱及貨物等在口岸間輸入輸出。僅2002年到2007年的五年間，衛(wèi)生檢疫 機(jī)構(gòu)就在入境交通工具、集裝箱、貨物中共捕獲各類病媒生物1. 8億多只，且捕獲數(shù)量呈現(xiàn) 逐年上升的趨勢。大量媒介生物的輸入對(duì)我國的衛(wèi)生安全特別是口岸地區(qū)的衛(wèi)生安全造成 極大的威脅。強(qiáng)化對(duì)出入境交通工具及集裝箱、貨物等的排查和對(duì)輸入性醫(yī)學(xué)媒介生物攜 帶病原體的檢測，是有效防止蟲媒傳染病通過國境口岸輸入、輸出，避免疫情大范圍爆發(fā)的 基礎(chǔ)和前提，也是國境口岸檢疫執(zhí)法和蟲媒疾病監(jiān)測的迫切需要。
[0007] 恙蟲病東方體檢測方法主要包括Giemsa染色、病原分離、間接免疫熒光試驗(yàn) (IFA)、分子生物學(xué)試驗(yàn)等，由于受樣品感染情況、檢測者實(shí)際操作水平等眾多因素的影響， Giemsa染色、病原分離和間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA)等檢測方法均存在著一定的局限性。隨 著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用到醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域， 該技術(shù)具有靈敏度高、特異性好和可靠性強(qiáng)等特點(diǎn)，而且能夠?qū)崿F(xiàn)多重反應(yīng)，自動(dòng)化程度 高。TaqMan技術(shù)是一種對(duì)單管PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測的技術(shù)，通過加入與靶基因 序列特異互補(bǔ)的雙熒光標(biāo)記探針，利用熒光信號(hào)的積累來實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，從而對(duì) 靶標(biāo)基因進(jìn)行定量或定性檢測。與常規(guī)TaqMan探針相比，美國應(yīng)用公司推出的TaqMan-MGB 探針技術(shù)不僅熒光本底得以降低，熒光光譜分辨率得以改善，由于探針3'端結(jié)合了 Minor groove binder結(jié)合物，使得探針的Tm值得以提高，同時(shí)提高了探針的雜交穩(wěn)定性和特異 性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有恙蟲病東方體檢測的不足問題，提供一種恙蟲病東方體 TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測體系統(tǒng)，包括引物和TaqMan-MGB探針序列，特異性 強(qiáng)；另外本發(fā)明還提供一種恙蟲病東方體TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測體方法， PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，該檢測方法特異性強(qiáng)，敏感性高，適合對(duì)高恙蟲病東方體進(jìn)行檢 測。
[0009] 本發(fā)明恙蟲病東方體TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測體系，包括一對(duì)引物 及一條TaqMan-MGB探針，引物和探針序列如下： 上游引物 Ot-F : 5 ' -TCTRCRCCAGTAATYATTCCTCC-3 ' R=A/G Y=T/C 下游引物 Ot-R :5' -TGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGC-3' 探針 Probe-O :5' -HEX-AAGGACCACACTCTAAT-3' 其中上游引物在第4位、第6位及第15位存在簡并性，同時(shí)在擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì) Taqman-MGB探針，在探針合成時(shí)5'端連接HEX熒光基團(tuán)。
[0010] 所述檢測體系中PCR反應(yīng)體系如下： TaqMan mix buffer 10 ? Ot-F (10 μΜ) 0.6 μL Ot-R (10 μΜ) 0.6 μL Probe-O (10 μΜ) 0. 6 I^L pMD18-T-〇t 1 μL 補(bǔ)足ddH20到20 μL 其中pMD18-T-〇t是提取質(zhì)粒作為恙蟲病東方體陽性對(duì)照樣品，合成序列如下： GAAAAAAATTATGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGCGTTGTCGTTGCCATTTTCAGCTAGTGCAATAGAAT TGGGGGAAGAAGGATTAGAGTGTGGTCCTTATGCTAAAGTTGGAGTTGTTGGAGGAATGATTACTGGCGTAGAATC TGCTCG0
[0011] 本發(fā)明恙蟲病東方體TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法： (1) 首先是引物和探針的合成：引物和探針設(shè)計(jì)步驟如下：1)通過GenBank收集恙蟲 病東方體基因序列并進(jìn)行同源性比對(duì)；2)以恙蟲病東方體Karp型恙蟲病東方體的56-kDa 蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物Ot-F和Ot-R ;3)依據(jù)PCR擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)的核酸序列設(shè)計(jì)特異性的 Taqman-MGB探針序列，并通過GenBank網(wǎng)站比對(duì)探針的特異性； (2) 恙蟲病東方體陽性對(duì)照樣品的合成：合成質(zhì)粒樣品，依據(jù)GenBank公布的恙蟲病東 方體基因序列（GI:63079111)，選取恙蟲病東方體引物擴(kuò)增區(qū)域核酸序列（153 bp)，委托寶 生物工程(大連）有限公司進(jìn)行基因合成，提取質(zhì)粒作為恙蟲病東方體陽性對(duì)照樣品，命名 為pMD18-T-〇t，合成序列如下： GAAAAAAATTATGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGCGTTGTCGTTGCCATTTTCAGCTAGTGCAATAGAAT TGGGGGAAGAAGGATTAGAGTGTGGTCCTTATGCTAAAGTTGGAGTTGTTGGAGGAATGATTACTGGCGTAGAATC TGCTCG ； (3) PCR反應(yīng)體系的建立：以循環(huán)閾值和熒光強(qiáng)度等作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以不同的引物濃度 (0. 2 PL~1 μυ和探針濃度（0. 2 PL~0. 8 μυ進(jìn)行配比，優(yōu)化最佳反應(yīng)體系如下： TaqMan mix buffer 10 M-L Ot-F (10 μΜ) 0.6 μL Ot-R (10 μΜ) 0.6 μL Probe-O (10 Μ-Μ) 0. 6 M-L pMD18-T-〇t 1 μL 補(bǔ)足 CldH2O 到 20 μL ; (4) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：通過優(yōu)化退火溫度，最佳PCR反應(yīng)條件如下： 50〇C 2min ;95°C IOmin ;95°C 15s，60°C lmin，循環(huán) 45 次，退火時(shí)收集熒光信號(hào)。
[0012] (5)檢測方法評(píng)價(jià)：對(duì)上述優(yōu)化的恙蟲病東方體TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測方法的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行評(píng)價(jià)，包括敏感性評(píng)價(jià)，特異性評(píng)價(jià)和重復(fù)性評(píng) 價(jià)。
[0013] 所述敏感性評(píng)價(jià)方法如下：以制備的pMD18-T_0t標(biāo)準(zhǔn)品(濃度梯度為：10^101)為 模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以Ig (濃度）為橫軸，以循環(huán)閾值Ct值為縱軸，繪 制恙蟲病東方體實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量關(guān)系曲線。
[0014] 所述特異性評(píng)價(jià)方法如下：以莫氏立克次體、普氏立克次體、立氏立克次體、Q熱 立克次體、噬吞噬細(xì)胞無形體及伯氏疏螺旋體病原體DNA為模板，同時(shí)以恙蟲病東方體陰 性的鼠類基因組DNA及恙蟲病東方體陰性的鼠類基因組DNA與pMDIS-T-Ot的混合物作為 陰性對(duì)照及陽性對(duì)照進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增曲線及Ct值進(jìn)行分析。
[0015] 所述重復(fù)性評(píng)價(jià)方法如下： 以同一批次制備的IO6個(gè)拷貝的pMD18-T-〇t標(biāo)準(zhǔn)品做為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò) 增，獲得較理想的擴(kuò)增曲線，通過對(duì)5次擴(kuò)增結(jié)果循環(huán)閾值（Ct)及Tm值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析； 以不同批次制備的IO3和10 7個(gè)拷貝的PMDlS-T-Ot標(biāo)準(zhǔn)品做為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定 量PCR擴(kuò)增，IO3批間重復(fù)性試驗(yàn)及10 7批間重復(fù)性試驗(yàn)均獲得較為理想的擴(kuò)增曲線，通過 對(duì)5次擴(kuò)增結(jié)果循環(huán)閾值（Ct值）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
[0016] 本發(fā)明與同類技術(shù)相比，具有顯著的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明以TaqMan探針技術(shù)為基礎(chǔ)，應(yīng) 用TaqMan-MGB探針技術(shù)設(shè)計(jì)并合成恙蟲病東方體探針，建立恙蟲病東方體TaqMan-MGB探 針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，對(duì)恙蟲病東方體進(jìn)行核酸檢測，該檢測方法操作簡便，檢測 周期短，特異性強(qiáng)，為國境口岸對(duì)恙蟲病東方體的快速檢測工作提供技術(shù)支持。
【附圖說明】
[0017] 圖1為恙蟲病東方體TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法敏感性試驗(yàn)擴(kuò) 增曲線，其中橫軸為循環(huán)次數(shù)，縱軸為熒光強(qiáng)度； 圖2為恙蟲病東方體TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法敏感性試驗(yàn)定量關(guān) 系曲線，其中橫軸為標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱軸為循環(huán)數(shù)； 圖3為恙蟲病東方體TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法特異性試驗(yàn)擴(kuò)增曲 線，其中橫軸為循環(huán)次數(shù)，縱軸為熒光強(qiáng)度； 圖4為恙蟲病東方體TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn) (106) 擴(kuò)增曲線，其中橫軸為循環(huán)次數(shù)，縱軸為熒光強(qiáng)度； 圖5為恙蟲病東方體TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法批間重復(fù)性試驗(yàn) (IO3)擴(kuò)增曲線，其中橫軸為循環(huán)次數(shù)，縱軸為熒光強(qiáng)度； 圖6為恙蟲病東方體TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法批間重復(fù)性試驗(yàn) (107) 擴(kuò)增曲線，其中橫軸為循環(huán)次數(shù)，縱軸為熒光強(qiáng)度。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不局限于具體實(shí)施 例。
[0019] 實(shí)施例1 恙蟲病東方體TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測體系，包括一對(duì)引物及一條 TaqMan-MGB探針，引物和探針序列如下： 上游引物 Ot-F : 5 ' -TCTRCRCCAGTAATYATTCCTCC-3 ' R=A/G Y=T/C 下游引物 Ot-R :5' -TGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGC-3' 探針 Probe-O :5' -HEX-AAGGACCACACTCTAAT-3' 其中上游引物在第4位、第6位及第15位存在簡并性，同時(shí)在擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì) Taqman-MGB探針，在探針合成時(shí)5'端連接HEX熒光基團(tuán)。
[0020] 所述檢測體系中PCR反應(yīng)體系如下： TaqMan mix buffer 10 ? Ot-F (10 μΜ) 0.6 μL Ot-R (10 μΜ) 0.6 μL Probe-O (10 μΜ) 0. 6 I^L pMD18-T-〇t 1 μL 補(bǔ)足ddH20到20 μL 其中pMD18-T-〇t是提取質(zhì)粒作為恙蟲病東方體陽性對(duì)照樣品，合成序列如下： GAAAAAAATTATGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGCGTTGTCGTTGCCATTTTCAGCTAGTGCAATAGAAT TGGGGGAAGAAGGATTAGAGTGTGGTCCTTATGCTAAAGTTGGAGTTGTTGGAGGAATGATTACTGGCGTAGAATC TGCTCG0