一種常溫等溫?zé)晒饪焖偻瑫r(shí)檢測(cè)多核酸目標(biāo)物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種常溫等溫?zé)晒饪焖偻瑫r(shí)檢測(cè)多核酸目標(biāo)物 的方法，是一種在常溫等溫條件下，對(duì)多個(gè)核酸目標(biāo)物同時(shí)進(jìn)行快速、實(shí)時(shí)、特異性檢測(cè)的 方法，可在體外臨床檢測(cè)、食品安全、生物安全以及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
【背景技術(shù)】
[0002] 核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一類分子生物學(xué)技術(shù)的總稱，它們能在某一特定溫度下保持 恒定，實(shí)現(xiàn)特定DNA或RNA片段拷貝數(shù)快速增加的過程。在核酸擴(kuò)增技術(shù)領(lǐng)域里，以聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)為代表的核酸非等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，在過去的20年里，已在疾病的臨床診斷方 面，以其快速、靈敏和特異的優(yōu)勢(shì)，日益取代了傳統(tǒng)的診斷方法，并也使一些之前無法完成 的診斷成為可能。以微生物病原體的診斷為例，傳統(tǒng)的金標(biāo)法培養(yǎng)法與后續(xù)發(fā)展的免疫檢 測(cè)法，都存在檢測(cè)時(shí)間過長(zhǎng)、操作繁瑣、以及靈敏性與特異性一般等缺點(diǎn)。但是PCR擴(kuò)增可 將原本需要幾天，甚至半個(gè)月才獲得結(jié)果的檢測(cè)流程簡(jiǎn)化至1-2天，給臨床診斷檢測(cè)領(lǐng)域 帶來了質(zhì)的飛越。
[0003] 由于PCR是以物理反復(fù)式變溫方式不斷產(chǎn)生線性DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增與復(fù)制，因此， 其注定需依賴溫度循環(huán)儀（thermocycler)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。相比而言，核酸擴(kuò)增技術(shù)的新分支， 核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)則具有更大的優(yōu)勢(shì)。因?yàn)榇祟悢U(kuò)增反應(yīng)的全過程均在同一溫度條件下進(jìn) 行，使對(duì)儀器的精密程度要求大大簡(jiǎn)化，反應(yīng)時(shí)間也相應(yīng)明顯縮短。例如可通過金屬浴、水 浴鍋、甚至是孵育箱或室溫即可完成反應(yīng)，因而它們更能滿足現(xiàn)場(chǎng)、臨床、突發(fā)性或應(yīng)急性 檢測(cè)的需求，進(jìn)而具有更大、更廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
[0004] 正是基于核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的廣闊應(yīng)用前景，世界各國(guó)都在此領(lǐng)域進(jìn)行積極與廣 泛的研宄。目前技術(shù)成熟且研宄較多的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)主要包括以下幾種：環(huán)介導(dǎo)核酸 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop mediated isothermal amplification, LAMP)，依賴于核酸序列的擴(kuò) 增技術(shù)（NASBA)，滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（RCA)，單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（SPIA)，依賴于解旋酶的等溫 擴(kuò)增技術(shù)（HDA)，鏈替換擴(kuò)增技術(shù)（SDA)，自主序列復(fù)制系統(tǒng)（3SR)與切刻內(nèi)切酶核酸恒溫 擴(kuò)增技術(shù)（NEMA)。但由于工作原理或引物設(shè)計(jì)原理的不同，其中僅有NASBA曾在同一反應(yīng) 管中實(shí)現(xiàn)過同時(shí)檢測(cè)兩種RNA的表達(dá)水平。此外，SDA法則是通過與微芯片技術(shù)相結(jié)合后， 才實(shí)現(xiàn)了多重?cái)U(kuò)增。因此在同一檢測(cè)管中，類似熒光定量PCR，通過熒光探針法在常溫等溫 的條件下實(shí)現(xiàn)核酸的多重檢測(cè)的案例，目前尚未見報(bào)道。
[0005] 當(dāng)前，熒光定量PCR或其多重反應(yīng)，因具備實(shí)時(shí)檢測(cè)、同時(shí)檢出多項(xiàng)指標(biāo)、高靈敏 度和準(zhǔn)確性等優(yōu)點(diǎn)，成為體外分子診斷的主要技術(shù)之一，被廣泛的應(yīng)用到許多領(lǐng)域，例如臨 床疾病診斷、病原菌的檢出、出入境動(dòng)植物的檢驗(yàn)檢疫等。但是它對(duì)精密設(shè)備，即熒光定量 PCR儀，的高度依賴性，使其主要集中在中心實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用，未能幫助實(shí)驗(yàn)人員真正在現(xiàn)場(chǎng) 實(shí)現(xiàn)核酸的快速檢測(cè)。此外，由于熒光定量PCR儀的高精密性，使得整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置過程相對(duì) 復(fù)雜，因此不但實(shí)驗(yàn)操作，而且結(jié)果的解讀也都需要受過專業(yè)訓(xùn)練的技術(shù)人員才能完成。這 些缺點(diǎn)更讓熒光定量PCR難以在基層檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室或單位推廣，因而資源匱乏的邊遠(yuǎn)地區(qū)則 更不便于使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對(duì)以上問題提供一種常溫等溫?zé)晒饪焖偻瑫r(shí)檢測(cè)多核酸目標(biāo) 物的方法，克服目前熒光PCR對(duì)精密儀器的依賴較大，且核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的PCR產(chǎn)物定量 不夠精確、目前尚不能實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)物的問題。
[0007] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：一種常溫等溫?zé)晒饪焖偻瑫r(shí)檢測(cè)多核酸目標(biāo)物 的方法，該方法包括以下步驟：
[0008] (1)單鏈結(jié)合蛋白將多個(gè)模板雙鏈的母鏈局部打開成單鏈；
[0009] (2)重組酶與多對(duì)引物結(jié)合成復(fù)合體，在輔助蛋白的作用下結(jié)合到母鏈上，多個(gè)熒 光探針也與互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合，所述的多個(gè)熒光探針中部標(biāo)記有四氫呋喃，四氫呋喃兩側(cè)分別 為熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)之間間距為2-6nt，熒光探針3'末端標(biāo)記阻 抑聚合酶延伸或擴(kuò)增的修飾基團(tuán)；
[0010] (3)DNA聚合酶結(jié)合到引物的3'末端，進(jìn)行子鏈的延生；
[0011] (4)核酸外切酶識(shí)別雙鏈狀態(tài)下的多個(gè)熒光探針上的四氫呋喃位點(diǎn)，酶切后使熒 光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)得以分離，釋放熒光；
[0012] (5)多個(gè)熒光探針被切斷后，露出了原本被探針3'末端修飾所封閉掉的3'-OH端， DNA聚合酶可以繼續(xù)延伸形成子鏈；
[0013] (6)通過檢測(cè)擴(kuò)增曲線的形狀，和熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，可對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行定性且半定 量檢測(cè)。
[0014] 進(jìn)一步的，所述的熒光探針長(zhǎng)度為46_52nt。
[0015] 進(jìn)一步的，所述的熒光探針3'末端標(biāo)記阻抑聚合酶延伸或擴(kuò)增的修飾基團(tuán)為 C3-spaCer、磷酸基團(tuán)、生物素、生物素-TEG或胺基中任意一種。
[0016] 進(jìn)一步的，所述的熒光基團(tuán)為 的任意一種。
[0017] 進(jìn)一步的，所述的淬滅基團(tuán)為BHQl或BHQ2。
[0018] 進(jìn)一步的，所述的重組酶的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，輔助蛋白的氨基酸序 列如SEQ ID No. 2所示，單鏈結(jié)合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示，DNA聚合酶的氨 基酸序列如SEQ ID No. 4所示，核酸外切酶的氨基酸序列如SEQ ID No. 5所示。
[0019] 進(jìn)一步的，所述的恒溫條件為25-42度。
[0020] 更詳細(xì)的，本發(fā)明中：
[0021] 多對(duì)引物，是針對(duì)多個(gè)核酸目標(biāo)物分別設(shè)計(jì)的多條寡核苷酸，其特征是：每?jī)蓷l 寡核苷酸組成一對(duì)引物，分別特異性識(shí)別一個(gè)核酸目標(biāo)物的上下游核苷酸序列；長(zhǎng)度在 30-35核苷酸（nt)之間，序列中無回文序列、連續(xù)單堿基重復(fù)序列和內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)；引物 Tm值不作為設(shè)計(jì)時(shí)主要考慮因素；最佳引物對(duì)需通過試驗(yàn)優(yōu)化篩選出，其擴(kuò)增產(chǎn)物為單一 條帶，無非特異性擴(kuò)增和明顯的引物二聚體；多對(duì)引物之間也不能相互形成結(jié)構(gòu)牢固的寡 核苷酸雙鏈。
[0022] 多個(gè)熒光探針（圖1)，是針對(duì)多個(gè)核酸目標(biāo)物分別設(shè)計(jì)的多條寡核苷酸長(zhǎng)單鏈， 其特征是：每條寡核苷酸單鏈專一性識(shí)別一個(gè)核酸目標(biāo)物序列的中部，不與引物特異識(shí)別 位點(diǎn)重疊；長(zhǎng)度為46-52nt，序列避免回文序列、連續(xù)單堿基重復(fù)和內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)；共有4 個(gè)修飾位點(diǎn)，中部距離5'端約30nt位置標(biāo)記一 dSpacer，即四氫呋喃（THF)，作為核酸內(nèi) 切酶識(shí)別位點(diǎn)，由于識(shí)別位點(diǎn)僅為一個(gè)核苷酸，因此設(shè)計(jì)探針顯得更為簡(jiǎn)單，也便于做多重 檢測(cè)時(shí)的探針設(shè)計(jì)；THF位點(diǎn)兩側(cè)分別標(biāo)記一個(gè)熒光基團(tuán)與一個(gè)淬滅基團(tuán)，兩基團(tuán)間距為 2-6nt ;3'末端標(biāo)記阻抑聚合酶延伸或擴(kuò)增的修飾基團(tuán)，例如C3-spacer、磷酸基團(tuán)、生物 素、生物素-TEG或胺基；探針的Tm值不作為設(shè)計(jì)的主要考慮因素；熒光基團(tuán)可從FAM、HEX、 JOE、VIC、Texas Red、Cy3、Cy5或TAMRA中選擇，淬滅基團(tuán)可選擇BHQl或BHQ2,以最大限度 地降低背景熒光噪音為原則。
[0023] 重組酶、單鏈結(jié)合蛋白、DNA聚合酶、輔助蛋白、與核酸外切酶，是經(jīng)基因工程改造 的重組工程酶，包括：1)均來源于天然菌中的有特定功能的活性蛋白，后經(jīng)基因工程改造； 2)在體外經(jīng)化學(xué)試劑，例如IPTG，或溫度的誘導(dǎo)后，在發(fā)酵培養(yǎng)的大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)可獲得 大量表達(dá)的目的蛋白；3)細(xì)胞破碎后，均經(jīng)過兩次蛋白純化，例如鎳柱純化與肝素柱純化， 從而獲得高純度的單一蛋白；4)純化后，蛋白經(jīng)過酶活性鑒定測(cè)試，從而獲得具有高活力 單位的蛋白酶；5)重組酶，負(fù)責(zé)與引物分別形成起始反應(yīng)復(fù)合物，可從大腸桿菌（E. coli) 重組酶RecA或T4 菌體重組酶uvsX等天然菌中選??；6)單鏈結(jié)合蛋白，負(fù)責(zé)結(jié)合DNA單 鏈，并穩(wěn)定解鏈時(shí)所形成的氣泡區(qū)，可從E. coli或T4的gp32蛋白等天然菌中選??；7)DNA 聚合酶，同時(shí)具備聚合活性與鏈置換活性，可從E. coli的DNA聚合酶I Klenow大片段、Bst 聚合酶、Phi-29聚合酶、或枯草芽胞桿菌PolI(Bsu)等天然菌中選?。?)輔助蛋白，負(fù)責(zé)協(xié) 助、促進(jìn)并穩(wěn)定起始反應(yīng)復(fù)合物與DNA鏈間的結(jié)合，例如可選擇T4的uvsY蛋白；9)核酸外 切酶，負(fù)責(zé)識(shí)別探針與子鏈形成的帶有切口的DNA雙鏈，作用于切口處酶切探針，釋放熒光 基團(tuán)的信號(hào)以便相應(yīng)儀器檢測(cè)到，例如可選擇E. coli的核酸外切酶exoIII或exoIV。各種 蛋白的序列詳見序列表。
[0024] 其它化學(xué)組分，是維持最適反應(yīng)環(huán)境的多種化學(xué)成分的混合物，所含組分包括 2-3%聚乙二醇（PEG)、20-30mMTris 堿、90-110mM 乙酸鉀（KAc)、4-6mM 二硫蘇糖醇（DTT)、 2_3mM 三磷酸腺苷（ATP)、45_55mM 磷酸肌酸二鈉鹽（PCr，Creatine phosphate disodium salt)、90_110ng/ μ I 磷酸肌酶（CK，Creatine kinase)、200_250uM 脫氧核糖核苷三磷酸 (dNTP)、5. 5-6. 5%海藻糖（Trehal