件下 與本發(fā)明基因雜交的序列。
[0060] 雜交條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知且可參見Current Protocols in Molecular Biology (《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》），紐約的約翰威利父子出版公司（John Wiley and Sons) (1989)，6. 3. 1-6. 3. 6。高度嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的優(yōu)選、非限制性示例是在約45攝氏度于 6X氯化鈉/檸檬酸鈉（SSC)中雜交，然后在50-65攝氏度于0. 2X SSC，0. 1 % SDS中洗滌一 次或多次。"足夠同源的"指某一生物標(biāo)志物的氨基酸或核苷酸序列，其相對第二氨基酸或 核苷酸序列含有足夠或最少數(shù)目的相同或等同（如有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基）氨基酸殘 基或核苷酸，從而第一和第二氨基酸或核苷酸序列有共同結(jié)構(gòu)域或基序和/或共同功能活 性。例如，有共同結(jié)構(gòu)域的氨基酸或核苷酸序列在結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列上有至少約50%同 源性、至少約60%同源性、至少約70%同源性、至少約80%同源性、和至少約90-95%同源 性，在本文中定義為足夠同源的。此外，有至少約50%同源性、至少約60-70%同源性、至少 約70-80%同源性、至少約80-90%同源性、和至少約90-95%同源性且有共同功能活性的 氨基酸或核苷酸序列在本文中定義為足夠同源的。
[0061] 比較序列和確定2種序列間的百分比同源性能用數(shù)學(xué)算法完成。用于比較序列 的優(yōu)選、非限制性數(shù)學(xué)算法不例是Karlin和Altschul (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68 的算法，如 Karlin和 Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77所 改良。將這種算法納入 Altschul 等·（1990) J. Mol. Biol. 215:403-10 的 NBLAST 和 XBLAST 程序（2. 0版）。BLAST核苷酸搜索能用NBLAST程序進(jìn)行，評分=100,字長=12,以獲得與 本發(fā)明TRL核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索能用XBLAST程序進(jìn)行，評分=50， 字長=3,以獲得與表1、表2和/或表3所列基因和/或寡核苷酸編碼的蛋白序列同源的 氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的缺口比對（gapped alignment)，間隙BLAST (Gapped BLAST)能如 Altschul 等，（1997) Nucleic Acids Research 25 (17) :3389-3402 所述使用。 使用BLAST和間隙BLAST程序時，能使用各程序（如XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。參 見http://www. ncbi. nlm. nih. gov。用于比較序列的另一優(yōu)選、非限制性數(shù)學(xué)算法示例是 Myers和Miller, CABIOS (1989)的ALIGN算法。使用ALIGN程序以比較氨基酸序列時，能使 用PAMl 20權(quán)重殘基表，缺口長度罰分為12和缺口罰分為4。
[0062] 本發(fā)明包括測量患有hedgehog通路活化所引起癌癥的受試者的腫瘤活檢中一個 或多個基因 GLI-1、0TX-2、SHR00M2、PDUM3、SPHK1、SFRP1、APBA2 和 SPATA20 的表達(dá)。可分 析所述表達(dá)水平并用于產(chǎn)生某一評分，所述評分能用于區(qū)分顯示hedgehog通路活化的腫 瘤患者與不顯示的患者。
[0063] 在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括測量表1所列GLI-1、0TX-2、SHR00M2、 PDUM3、SPHK1、SFRP1、APBA2和SPATA20中的任意一種。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的方 法包括測量表1中至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、或至少8 個基因。
[0064] 在一個示例中，測量來自表1的一個基因如GLI-I的表達(dá)水平。在另一個示例中， 測量來自表1的2個基因如GLI-1、0TX-2的表達(dá)水平。在另一個示例中，測量來自表1的 3個基因 GLI-1、0TX-2和SHR00M2的表達(dá)水平。在另一個示例中，測量來自表1的4個基 因 GLI-1、0TX-2、SHR00M2或的表達(dá)水平。在另一個示例中，測量來自表1的5個基 因 GLI-1、OTX-2、SHR00M2、PDUM3 和 SPHKl 的表達(dá)水平。
[0065]
[0066] 表 1
[0067] 本發(fā)明的生物標(biāo)志物還包括表1所鑒定基因的任何組合，其表達(dá)水平 或基因產(chǎn)物用作預(yù)測性生物標(biāo)志物。本發(fā)明的生物標(biāo)志物，包括其基因序列是 本領(lǐng)域已知的（如上所提供），或例如，用于GLI-I ((GLI家族鋅指I ;Nature 332:371-374 (1988))，用于 OTX-2 (正小齒同源異形盒 2 ;EBO 12:2735-2747 (1993))， 用于 SHROOM2 (Shroom 家族成員 2 ;Hum. Mol. Genet. 4:373-382 (1995))，用于 PDUM3 (PDZ 和 UM 結(jié)構(gòu)域 3 J. Cell Biol. 139:507-515(1997))，用于 SPHKl(鞘氨醇激酶 1 ; Gene 251:19-26 (2000))，用于 SFRPl (分泌性卷曲相關(guān)蛋白 I ;Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 94:6770-6775(1997))，用于ΑΡΒΑ2(β淀粉樣（A4)前體蛋白結(jié)合蛋白A家族； J. Bioh Chem. 272:31459-31464(1997))，用于 SPATA20(精子發(fā)生相關(guān)基因20屮1"〇(^恥七1· Acad. Sci. U. S. A. 99 (26)，16899-16903 (2002))。
[0068] 本發(fā)明方法中，測量表1所述一個或多個基因的表達(dá)水平并分析和與對照作比 較。用于比較的對照能由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。在一個示例中，通過選擇作為截留值的值 來確定對照。例如，所述值可以是區(qū)分以下的值：如區(qū)分hedgehog活化（hedgehog+)的測 試樣品與不顯示hedgehog活化（hedgehog-)的測試樣品。在另一個示例中，本發(fā)明生物標(biāo) 志物的基因表達(dá)概況與對照（在取自健康人或hedgehog活化腫瘤的樣品中存在所述生物 標(biāo)志物的表達(dá)）作比較。
[0069] 在本發(fā)明的特定實(shí)施方式中，預(yù)先確定對照并產(chǎn)生某一評分，所述評分能用于 選擇有hedgehog通路活化所引起的腫瘤的那些受試者。所述表達(dá)閾值可用于選擇響應(yīng) hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的個體。
[0070] 在另一個示例中，對照可包括一個或多個標(biāo)準(zhǔn)化基因（如下所述），所述基因顯示 相對恒定的基因表達(dá)水平。所述標(biāo)準(zhǔn)化基因校正（標(biāo)準(zhǔn)化）RNA測定量以及所用RNA品質(zhì) 變化的差異。因此，所述試驗(yàn)通常測量并納入某些標(biāo)準(zhǔn)化基因，如表2所示的標(biāo)準(zhǔn)化基因的 表達(dá)。
[0071]
[0072] 表 2
[0073] 本發(fā)明的一種方法中，測量表1中一個或多個基因（如2、3、4、5、6、7或8個基因） 的表達(dá)且一般在由表2所述單個對照基因的表達(dá)水平或者4個或3個或2個對照基因均 值標(biāo)準(zhǔn)化后轉(zhuǎn)變成表達(dá)值。然后，這些表達(dá)值會用于產(chǎn)生隨后與截留值作比較的評分，以 選擇有Hedgehog活化腫瘤并因而可能受益于Hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑治療的受試者。在 一個示例中，測量GLI-1、OTX-2、SHR00M2、和SPHKl中至少2個、3個、4個或所有5 個基因的mRNA水平，所述mRNA值在由表2所述單個對照基因的表達(dá)水平或者4個或3個 或2個對照基因均值標(biāo)準(zhǔn)化后轉(zhuǎn)變成表達(dá)值。本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)化基因含UBA和WffE結(jié)構(gòu)域 的基因1(UBA and WffE domain containing I) (HUWEI)、La核糖核蛋白結(jié)構(gòu)域家族，成員 I (LARPl)、本發(fā)明的超氧化物歧化酶1，可溶性（SODl)、YMEl樣I (YMElLl)(包括其基因序 列）為本領(lǐng)域已知，例如上面提供了 NCBI所提供的基因序列登錄號。
[0074] 本發(fā)明的生物標(biāo)志物能用本領(lǐng)域已知的任何方法如逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR)測量。所述方法包括用本領(lǐng)域已知和如上所述的任何技術(shù)，例如使用來自商業(yè)生 產(chǎn)商如凱杰公司（Qiagen)的純化試劑盒、緩沖液組和蛋白酶來分離mRNA。逆轉(zhuǎn)錄步驟通常 根據(jù)環(huán)境和表達(dá)概況分析的目標(biāo)用特異引物、隨機(jī)六聚體、或寡dT引物引發(fā)，所得cDNA可 隨后用作后續(xù)PCR反應(yīng)的模板。然后，可以利用例如市售可得設(shè)備進(jìn)行TaqMan(R)RT-PCR。
[0075] 然后，所分離的mRNA可以用本領(lǐng)域已知的任何方法如微陣列分析、定量（'實(shí) 時'）PCR、northern印跡和核酸酶保護(hù)分析進(jìn)一步分析。在一個示例中，使用經(jīng)雙重標(biāo) 記熒光生成探針（如用TaqMan(R)探針）測量PCR產(chǎn)物累積的實(shí)時定量PCR。實(shí)時PCR 與以下2種定量競爭PCR都相容：前者中使用各靶序列的內(nèi)部競爭物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，后者 用樣品所含標(biāo)準(zhǔn)化基因或用于RT-PCR的管家基因。更多詳述參見例如Held等，Genome Research6:986-994(1996)。在實(shí)時PCR測定中，通過熒光信號積累檢測陽性反應(yīng)。Ct (循 環(huán)閾值）定義為熒光信號跨越閾值（即超過背景水平）所需的循環(huán)數(shù)。Ct水平與樣品中的 靶核酸量成反比（即Ct水平越低，樣品中的靶核酸量越高）。大部分實(shí)時測定經(jīng)歷40個擴(kuò) 增循環(huán)。
[0076] 在另一個示例中，使用微陣列，其包括與基因 GLI-1、OTX-2、SHR00M2、 SPHK1、SFRP1、APBA2和SPATA20中一個或多個對應(yīng)的一個或多個探針。微陣列的應(yīng)用在陣 列表面生成經(jīng)標(biāo)記靶核酸的雜交模式。所得經(jīng)標(biāo)記核酸的雜交模式可通過多種方法呈現(xiàn)或 檢測，特定檢測方式根據(jù)靶核酸的特定標(biāo)記進(jìn)行選擇。代表性檢測方式包括閃爍計(jì)數(shù)、放射 自顯影、熒光測量、熱量測定、光發(fā)射測量、光散射等。
[0077] 在另一個示例中，能使用TaqMan?低密度陣列（TLDA)，其可包括與基因 GLI-1、 OTX-2、SHROOM2、PDUM3、SPHKl、SFRPl、APBA2 和 SPATA20 中一個或多個對應(yīng)的一個或多個 探針。此方法使用進(jìn)行同步實(shí)時PCR反應(yīng)的微流體卡。
[0078] 在一個示例中，檢測方法采用市售可得的陣列掃描儀（加利福尼亞州圣克拉拉的 昂飛（Affymetrix))，例如 417 點(diǎn)樣儀（417. TM. Arrayer)、418 陣列掃描儀（418. TM. Array Scanner)、或安捷倫（Agilent)基因陣列掃描儀（GeneArray. TM. Scanner)。此掃描儀由系 統(tǒng)計(jì)算機(jī)控制，所述計(jì)算機(jī)有界面和易用軟件工具。輸出可直接輸入多種軟件應(yīng)用或通過 多種軟件應(yīng)用來直接讀取。掃描裝置描述于例如美國專利號5, 143, 854和5, 424, 186。
[0079] 牛物標(biāo)志物基閔產(chǎn)物的表汰檢測
[0080] 檢測由 GLI-I、OTX-2、SHROOM2、PDLIM3、SPHKl、SFRPl、APBA2 和 SPATA20 中一 個或多個所編碼蛋白產(chǎn)物的存在能用本領(lǐng)域已知的任何合適方法完成。例如，可以用于 檢測目標(biāo)特定蛋白的目標(biāo)試劑，如使用抗體。與本發(fā)明所用多肽特異性結(jié)合的多克隆 和/或單克隆抗體的生成方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，可參見例如Dymecki等（J. Biol. Che