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      葡萄炭疽病菌lamp檢測(cè)引物組及其檢測(cè)方法

      文檔序號(hào):9258187閱讀:615來源:國知局
      葡萄炭疽病菌lamp檢測(cè)引物組及其檢測(cè)方法
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001]本發(fā)明涉及一種葡萄炭疽病菌LAMP檢測(cè)引物組及其檢測(cè)方法,專用于葡萄炭疽病菌高靈敏度快速分子檢測(cè),同時(shí)可用于田間葡萄炭疽病的早期診斷和病原菌的監(jiān)測(cè)與鑒定,屬于果樹病害檢測(cè)、鑒定及防治技術(shù)領(lǐng)域。
      【背景技術(shù)】
      [0002]葡萄炭疽病(Elsinoe ampelina)是引起果實(shí)腐爛的重要真菌病害之一,其病原是膠抱炭疽菌(Colletotrichum gloeospor1ides)和尖抱炭疽菌(C.acutatum)。美國于1891年最先報(bào)道葡萄炭疽病害,之后在世界很多地區(qū)均發(fā)現(xiàn)該病害。葡萄感染病原菌后,不僅造成產(chǎn)量嚴(yán)重減少,而且品質(zhì)也受到嚴(yán)重影響。早期研宄認(rèn)為葡萄炭疽病是由膠孢炭疽菌感染引起的,隨后在美國、日本和澳大利亞等的研宄發(fā)現(xiàn)尖孢炭疽菌也可侵染葡萄引起葡萄炭疽病。
      [0003]目前對(duì)葡萄炭疽病菌的檢測(cè)大多仍沿用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)及鑒定方法,然而,傳統(tǒng)檢測(cè)法耗時(shí)、耗力、效率低,且要求操作者具備專業(yè)的病原菌分離技術(shù)和豐富的形態(tài)學(xué)鑒定知識(shí)與經(jīng)驗(yàn)。葡萄炭疽病菌從感染到發(fā)病有一個(gè)相當(dāng)長的潛伏期,容易因低效的檢測(cè)方法而錯(cuò)過早期診斷和防治的最佳時(shí)機(jī)。因此,探索一套快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異的葡萄炭疽病菌檢測(cè)技術(shù),做好葡萄炭疽病的早期診斷,對(duì)防止該病害傳播具有極其重要的意義。
      [0004]PCR技術(shù)能夠較快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出病原,但需要特定的儀器設(shè)備且檢測(cè)成本較高,不適宜基層檢驗(yàn)檢疫部門田間大規(guī)模應(yīng)用,致使田間病情無法得到及時(shí)、準(zhǔn)確的檢測(cè)和有效的控制。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplificat1n,LAMP)技術(shù)是由Notomi等于2000年開發(fā)的一種高效的核酸恒溫?cái)U(kuò)增方法。LAMP反應(yīng)在等溫條件下,短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的大量擴(kuò)增,具有很高的特異性和靈敏度,且操作步驟簡便,檢測(cè)結(jié)果可由肉眼判斷,因此更適合于基層檢驗(yàn)檢疫部門開展工作,具有極為廣泛的應(yīng)用前景。目前LAMP檢測(cè)主要應(yīng)用于人畜病原物、食品安全和環(huán)境衛(wèi)生的檢測(cè),在植物病原菌檢測(cè)中報(bào)道較少,葡萄炭疽病菌LAMP檢測(cè)國內(nèi)外均未見報(bào)道。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)中的不足之處,本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種葡萄炭疽病菌LAMP檢測(cè)引物組,本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供葡萄炭疽病菌LAMP檢測(cè)方法。本發(fā)明的檢測(cè)方法經(jīng)一次恒溫?cái)U(kuò)增,就可以達(dá)到快速檢測(cè)葡萄炭疽病菌的目的,檢測(cè)結(jié)果可靠、靈敏度高、特異性強(qiáng)且易于操作,可用于田間葡萄炭疽病的早期診斷和病原菌的監(jiān)測(cè)與鑒定,為葡萄炭疽病菌引起的病害的防治提供可靠的技術(shù)和理論依據(jù)。
      [0006]為了實(shí)現(xiàn)上述第一個(gè)目的,本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
      葡萄炭疽病菌LAMP檢測(cè)引物組設(shè)計(jì)從GenBank中下載葡萄炭疽病菌ITS序列(登錄號(hào):AB218993.1 ),根據(jù)葡萄炭疽病菌ITS序列,采用PrimerExplorer V4軟件設(shè)計(jì)一種LAMP檢測(cè)引物組,包括I對(duì)外引物(TJ-F3和TJ-B3)和I對(duì)內(nèi)引物(TJ-FIP和TJ-BIP),引物序列分別為:
      TJ-F3: 5' -ATGCCTGTTCGAGCGTCA-3'
      TJ-B3: 5' -TCCGAGGTCAACCTTTGGAA-3'
      TJ-FIP:5' -GCCACTACCTTTGAGGGCCTACTTTCAACCCTCAAGCTCTGC-3'
      TJ-BIP:5' -CGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAAGGGTTTTACGGCAAGAGTCC-3'
      為了實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的,本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
      葡萄炭疽病菌LAMP檢測(cè)方法,該方法包括以下步驟:
      Cl)按常規(guī)方法提取葡萄炭疽病菌基因組DNA ;
      (2)葡萄炭疽病菌LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系,所述的LAMP反應(yīng)體系25 μ?:包括引物組5μΜTJ-F3、5PM υ_Β3、40μΜ TJ-FIP 和 40μΜ TJ-BIP 各 ?μ?,12.5.Ομ? 反應(yīng)混合液,?μ? 熒光顯色劑,WL m) Bstmk聚合酶,50ng DNA模板,用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至25 μ?。混勻,進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增,后滅活。
      [0007](3)所述恒溫?cái)U(kuò)增溫度范圍為61°C ~65°C,反應(yīng)時(shí)間60 ~70min,82°C滅活1min ;
      (4)LAMP反應(yīng)結(jié)果檢測(cè)方法為熒光染料目測(cè)觀察法和瓊脂糖凝膠電泳法。所述熒光染料目測(cè)觀察法:在LAMP反應(yīng)前于反應(yīng)液中加入WL熒光顯色劑,所述熒光顯色劑為1.25mM鈣黃綠素和12.5mM氯化錳混合液,觀察到亮綠色熒光判斷為陽性,橙色判斷為陰性;或取2^1擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),如出現(xiàn)梯形條帶判斷為陽性,無擴(kuò)增條帶則判斷為陰性。
      [0008]所述的反應(yīng)混合液中含有12 mmol /T, MgS04、2mmol/L dNTPs、1.6mol/L Betaine、2% TWeen_20、5 μ L 10 X Thermopol Buffer0
      [0009]有益效果:本發(fā)明方法適用于發(fā)病植株或果實(shí)中葡萄炭疽病菌的高靈敏度快速分子檢測(cè)和鑒定,對(duì)葡萄炭疽病菌引起的病害防治具有重要的實(shí)用價(jià)值。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比,具有以下技術(shù)優(yōu)勢(shì):
      1、結(jié)果可靠:本發(fā)明所設(shè)計(jì)出的LAMP檢測(cè)引物組,已對(duì)中國福建、江西和北京等地的葡萄炭疽病菌進(jìn)行了測(cè)試驗(yàn)證,因此充分保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性;
      2、特異性強(qiáng):本發(fā)明所采用的LAMP引物組是針對(duì)葡萄炭疽病菌ITS序列中6個(gè)不同區(qū)域設(shè)計(jì)出4條特異性引物,因此大大提高了檢測(cè)特異性。
      [0010]3、靈敏度高:LAMP對(duì)葡萄炭疽病菌的檢測(cè)靈敏度在DNA水平上可達(dá)到500fg。
      [0011]4、實(shí)用性好:本發(fā)明所設(shè)計(jì)出的LAMP引物組,可用于帶葡萄炭疽病菌的植株和果實(shí)的高靈敏度快速檢測(cè)和鑒定,具有很強(qiáng)的實(shí)用性;
      5、操作簡單:應(yīng)用本發(fā)明方法,可在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成對(duì)帶葡萄炭疽病菌的植株和果實(shí)的檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。LAMP檢測(cè)在等溫條件下進(jìn)行,只需一個(gè)恒溫水浴鍋即可,不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備、操作步驟和昂貴的分子試劑,檢測(cè)結(jié)果肉眼可直接觀察。
      【附圖說明】
      [0012]圖1為本發(fā)明葡萄炭疽病菌LAMP特異性檢測(cè)結(jié)果圖。其中:M為DL 2000 DNAmarker, I為陽性對(duì)照,2為陰性對(duì)照,3_7為葡萄炭疽病菌,8_11為其他真菌和卵菌。
      [0013]圖2為本發(fā)明葡萄炭疽病菌LAMP靈敏度檢測(cè)結(jié)果圖。其中:M為DL 2000 DNAmarker, 1- 8 分別為 50ng, 5ng, 500 pg, 50 pg, 5pg, 500 fg, 50 fg 和 5fg。
      [0014]圖3為本發(fā)明發(fā)病果實(shí)檢測(cè)結(jié)果圖。其中:M為DL 2000 DNA marker, I為陽性對(duì)照,2為陰性對(duì)照,3-5為發(fā)病果實(shí),6-8為健康果實(shí)。
      【具體實(shí)施方式】
      [0015]本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容包括葡萄炭疽病菌LAMP檢測(cè)引物組,LAMP引物及其序列分別為:
      TJ-F3: 5' -ATGCCTGTTCGAGCGTCA-3'
      TJ-B3: 5' -TCCGAGGTCAACCTTTGGAA-3'
      TJ-FIP:5' -GCCACTACCTTTGAGGGCCTACTTTCAACCCTCAAGCTCTGC-3'
      TJ-BIP:5' -CGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAAGGGTTTTACGGCAAGAGTCC-3'
      利用LAMP引物組檢測(cè)葡萄炭疽病菌顯色結(jié)果可觀察到亮綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)梯形條帶。
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