口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制作方法
【專利說明】口歸疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒
[0001] 本申請為對申請?zhí)枮?01310351271. 7專利申請的分案申請技術(shù)領域
[0002] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領域，更具體地，本發(fā)明設及一種口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，特別是口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0003] 口蹄疫（Foot-and-MouthDisease,FMD)是世界范圍內(nèi)廣泛分布，在國際間傳播蔓 延的全球性流行性傳染病。國際獸醫(yī)局（01巧在1984年修訂的動物傳染病分類中將口蹄疫 列為A類傳染病之首?？谔阋呤怯煽谔阋卟《荆‵oot-and-MouthDiseaseVirus，F(xiàn)MDV)感 染引起偶蹄動物的一種高度接觸性人畜共患傳染病。其特點是發(fā)病急、傳播快、傳染率高， 造成畜群生產(chǎn)性能迅速下降，給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟損失，嚴重制約經(jīng)濟發(fā)展?？谔阋?發(fā)病的主要癥狀為：口腔粘膜、舌、唇、鼻鏡、蹄叉、乳頭等部位發(fā)生水瘤，破潰形成爛斑，病 畜蹄痛、嚴重者蹄殼邊緣潰裂或脫殼。不同動物的癥狀稍有不同，妊娠母?？赡芰鳟a(chǎn)，而后 導致繁殖力降低；豬則W破蹄為最主要癥狀；山羊和綿羊的癥狀通常比牛溫和?？谔阋邆?染性高，傳播迅速，感染豬、牛、羊等牲畜常導致幼畜死亡，成年動物生產(chǎn)能力急劇下降，嚴 重危害畜牧業(yè)的發(fā)展和畜產(chǎn)品的生產(chǎn)供應。同時會引發(fā)流行國家或地區(qū)動物及動物產(chǎn)品的 市場流通，并使其國際貿(mào)易受到及大的封鎖和限制，給流行國家和地區(qū)的畜牧業(yè)生產(chǎn)造成 了巨大經(jīng)濟的損失。因此口蹄疫歷來受到各國政府的高度重視。
[0004] 口蹄疫病毒屬于小核糖核酸病毒科，口蹄疫病毒屬。由"假"20面體對稱的衣殼和 病毒核酸構(gòu)成，該病毒粒子的整個外形是球形，不是嚴格的正20面體。完整的病毒顆粒包 括衣殼和RNA兩部分，衣殼由VP1，VP2,VP3和VP4等4種結(jié)構(gòu)蛋白各60個分子組成。研究 表明，結(jié)構(gòu)蛋白VP1是誘導產(chǎn)生中和抗體的主要成分，它暴露在病毒粒子的表面。
[0005] 目前，口蹄疫的防治主要依靠疫苗免疫。我國對口蹄疫施行強制性免疫，每年春秋 進行一次集中免疫，兩次之間對新補欄家畜及時進行補免。在實際生產(chǎn)中如何鑒別診斷易 感動物是進行了疫苗免疫還是感染了口蹄疫病毒對口蹄疫防疫體系的建立、檢驗檢疫都是 十分重要的。世界各國也在該領域開展了廣泛的研究。ELISA方法具有特異、敏感、快速、簡 便、可靠性好等特點，且能自動化操作，并能迅速的檢測大量樣品，在FMD的診斷中日益受 到人們的重視，現(xiàn)已成為國際上檢測易感動物豬、牛等是否疫苗免疫或感染病毒的常規(guī)方 法之一。
[0006] 口蹄疫是關系到國家經(jīng)濟安全的重大動物疫病，相關關鍵技術(shù)應該牢牢掌握在自 己手里。一旦我們擁有自主知識產(chǎn)權(quán)，將利于保障我國的經(jīng)濟安全。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種新的用于診斷口蹄疫易感動物豬是否感染口蹄疫病毒 的口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
[0008] 本發(fā)明還提供提供口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VPl抗原表位多膚，為由序列表中序列1 所示的多膚或者序列表中序列2所示的多膚。
[0009] 本發(fā)明的口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋 白VP1抗原表位多膚包被的酶聯(lián)反應板和酶標記抗抗體；所述口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗 原表位多膚為序列表中序列1所示的多膚和序列表中序列2所示的多膚。
[0010] 所述序列表中序列1所示的多膚和序列表中序列2所示的多膚的質(zhì)量比為 0. 5-2. 0 : 1，優(yōu)選為1 : 1。所設及的包被抗原采用固相化學合成的方法生產(chǎn)，包被抗原含 有口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1的主要抗原位點，可與口蹄疫病毒感染后產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)蛋白VP1 抗體特異結(jié)合。
[0011] 所述酶標記抗抗體的標記酶為辣根過氧化物酶或堿性磯酸酶；所述酶標記抗抗體 為酶標記兔抗豬IgG;所述酶標記抗抗體優(yōu)選為辣根過氧化物酶標記的兔抗豬IgG，更優(yōu)選 為辣根過氧化物酶標記的兔抗豬IgG多克隆抗體）。
[0012] 所述酶聯(lián)反應板為可拆卸96孔酶標板；所述口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗原表位多 膚為化學人工合成得到。
[0013] 所述口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗原表位多膚包被的酶聯(lián)反應板的板的最佳制備 條件是；將所述口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗原表位多膚溶于100y1的抑9. 4的碳酸鹽溶 液，然后加到96孔聚苯己締酶聯(lián)反應板，每孔50ng抗原，在37°C放置2-4小時，再4-8°C下 放置過夜使多膚抗原與酶聯(lián)反應板充分結(jié)合，然后按照300 ^1/孔加入含有1 % (g/ml)牛 血清白蛋白抑7. 4的PBS緩沖液，37°C封閉處理1-2小時，洗漆后甩干，待酶聯(lián)反應板干燥 后4 °C密封保存。
[0014] 所述試劑盒中含有顯色液和終止液；當標記酶為辣根過氧化物酶時顯色液由顯色 液A液和顯色液B液組成，所述顯色液A液為含0.05% (g/ml)過氧化氨尿素的巧樣酸磯酸 鹽緩沖液，所述顯色液B液為0.02% (g/ml)的四甲基聯(lián)苯胺溶液；當標記酶為堿性磯酸酶 時，顯色液為4-硝基酪磯酸鹽緩沖液；所述終止液為2mol/L的硫酸溶液。
[0015] 所述試劑盒還包括陰性對照血清、陽性對照血清；所述陰性對照血清為用無口蹄 疫抗體的正常豬血清；所述陽性對照血清為W所述口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗原表位多膚 為免疫原免疫豬得到的血清；
[0016] 所設及的陽性對照血清是具體是已上述人工化學合成的包被抗原作為免疫原，免 疫25-35日齡無特定病源體（SP巧豬，制備高免血清，加入lOOOU/ml鏈霉素和lOOOU/ml青 霉素，過0. 2ym濾膜除菌，作為試劑盒的陽性對照血清。
[0017] 所設及的陰性對照血清是用無口蹄疫抗體的正常豬血清，加入lOOOU/ml鏈霉素 和lOOOU/ml青霉素，過0. 2ym濾膜除菌，作為試劑盒陰性對照血清。
[0018] 所述試劑盒還包括樣品稀釋液和濃縮洗漆液；樣品稀釋液為含有3% (g/ml)BSA 的0. 15M、抑為7. 4的PBS緩沖液（過0. 45ym濾膜）；濃縮洗漆液；0. 01M，抑7. 4,含有 0.8%~1.2% (ml/ml)Tween-20和0.05% (g/ml)疊氮鋼防腐劑的磯酸鹽緩沖液（經(jīng)過 0. 2ym濾膜除菌）。
[0019] 所述試劑盒還包括說明書，所述說明書可W記載如下內(nèi)容：
[0020] 本發(fā)明試劑盒的檢測程序為：
[0021] 1、平衡；將保存在4°C的試劑盒取出，平衡至室溫備用；液體試劑用前混勻。
[0022] 2、配液；將濃縮洗漆液用蒸饋水或去離子水20倍稀釋得到洗漆緩沖液；
[0023] 3、設定；留1個空白孔，3個陰性對照孔，和2個陽性對照孔，其余為待測樣本孔。
[0024] 4、待測標本預稀釋；使用樣品稀釋液將待檢樣品血清、陰性對照血清、陽性對照血 清按照1 : 21的比例稀釋；往稀釋板孔內(nèi)每孔加lOOyl樣本稀釋液，分別加入5yl待測 樣本。
[0025] 5、加樣誼白孔不加樣；3個陰性對照孔各加100y1陰性對照，2個陽性對照孔各 加 100y1陽性對照；其余孔分別按預先設定加100y1稀釋的待測樣本。加樣過程時間跨 度應盡量短。
[002引 6、溫育；震蕩混勻，置37°C溫箱或水浴鍋中，反應30分鐘。
[0027] 7、洗板；棄去反應液，每孔加300y1步驟2中得到的洗漆緩沖液，浸泡15秒，甩棄 洗液。連續(xù)洗板4次后拍干。
[0028] 8、加酶；空白孔不加酶；其余各孔加100y1辣根過氧化物酶標記的兔抗豬IgG。
[002引 9、溫育遺37°C溫箱或水浴鍋中，反應30分鐘。
[0030] 10、洗板；棄去反應液，每孔加入稀釋后的洗漆緩沖液300 ^1，浸泡15秒，甩棄洗 漆液。連續(xù)洗板5次后拍干。
[0031] 11、顯色每孔分別加入100y1的底物顯色液（其中溶液I和溶液II的W體積比 為1 : 1的比例混合）。加蓋，37°C恒溫箱里反應15min;
[0032] 12、每孔分別加入50y1終止液終止反應，混勻；
[0033] 13、測