素進(jìn)行測(cè)序，而選用經(jīng)碘乙酰胺烷基化修飾后的毒素肽作為測(cè)序樣品，因?yàn)闆]有經(jīng)碘乙酰胺修飾的半胱氨酸(cysteine)在214 nm波長檢測(cè)下沒有吸收值，觀察不到信號(hào)，不便于準(zhǔn)確定位半胱氨酸在多肽中的位置，而經(jīng)修飾的半胱氨酸的PTH-CM-Cys出峰信號(hào)明顯，在線HPLC檢測(cè)能夠確證多肽序列中半胱氨酸的位置。根據(jù)毒素分子量推測(cè)其含有氨基酸殘基的數(shù)目，然后設(shè)定實(shí)際測(cè)序循環(huán)數(shù)，即I個(gè)空白循環(huán)+1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)+氨基酸殘基數(shù)目。
[0016]2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
2.1 SPKP-X的分離純化
由于廣西纓毛蛛成分非常復(fù)雜，通常采用二維色譜的方法分離純化毒素多肽:即首先經(jīng)過陽離子交換分離粗毒后，洗脫成分進(jìn)一步采用反相HPLC分離純化。二維色譜是一種非常有效的分離純化的方法，通過陽離子交換HPLC以及反相HPLC兩步分離，我們從廣西纓毛蛛粗毒中成功分離到SPKP-Χ。圖1是廣西纓毛蛛粗毒的陽離子交換HPLC圖譜，在280nm波長下檢測(cè)，可觀察到9個(gè)非常明顯的洗脫峰，其中第9個(gè)峰是目的峰。收集此峰后，在AKTA純化系統(tǒng)上進(jìn)行脫鹽處理所得圖譜見圖2。收集目的峰并冷凍干燥后，在Alliance系統(tǒng)上進(jìn)行再次反相HPLC (見圖3)。圖中顯示含SPKP-X的洗脫峰為單一峰，通過質(zhì)譜鑒定它們的純度達(dá)到98%以上。
[0017]2.2質(zhì)譜分析
將圖4所示洗脫峰用MALD1-T0F質(zhì)譜分析表明所含組分單一。用HWTX-1進(jìn)行內(nèi)標(biāo)校正，經(jīng)鑒定SPKP-X的分子量分別為3706.2 Da。從圖上看，樣品很純，說明目的肽的分離純化是很成功的。
[0018]2.3氨基酸序列分析
SPKP-X的序列測(cè)定在491-A測(cè)序儀上進(jìn)行。測(cè)序之前對(duì)SPKP-X進(jìn)行碘乙酰胺烷基化修飾，結(jié)果表明，SPKP-X是單鏈多肽分子，由31個(gè)氨基酸殘基組成，其中包括6個(gè)Cys。將該多肽經(jīng)碘乙酰胺修飾后測(cè)定分子質(zhì)量，修飾后的分子量比天然肽的分子量都增加了 348Da。由于每修飾一個(gè)半胱氨酸，則天然毒素的分子量增加58 Da，由此推斷:SPKP-X含有6個(gè)半胱氨酸，形成三對(duì)二硫鍵。
[0019]SPKP-X的序列排列模式為CX6CX5CXtl CX4CX6C (其中X代表除半胱氨酸殘基之外的任何一種氨基酸，數(shù)字代表氨基酸的個(gè)數(shù))，這種模式符合ICK模型定義:CX3_7CX4_6CXQ_5CXQ_4CX3_13C。根據(jù)序列同源性比對(duì)分析，除了同從 Gorem1ciwmis Validus中分離得到的CvTX-1I和來源于Grammns to la,毒液的omega-GsTx SIA分別有61%和40%的序列相似性外，SPKP-X與其他已知毒素序列相似性都比較低，說明SPKP-X是新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)序列獨(dú)特的蜘蛛毒素分子。盡管如此，SPKP-X與其它ICK模體毒素半胱氨酸殘基位置非常保守，我們推測(cè)SPKP-X也是一種ICK模體多肽毒素。
[0020]2.4 SPKP-X的同源結(jié)構(gòu)模建
由于SPKP-X與omega-GsTx SIA有40%的序列相似性，故以omega-GsTx SIA的結(jié)構(gòu)為模板，對(duì)SPKP-X進(jìn)行了結(jié)構(gòu)模建。該分子與其它離子通道毒素一樣，具有二鏈反平行b —折疊片的二級(jí)結(jié)構(gòu)，分子屬于典型的ICK結(jié)模體。這些毒素都具有類似的二硫鍵配對(duì)方式及相似的三維空間結(jié)構(gòu)，同屬于ICK模體家族，結(jié)構(gòu)的相似性為研宄SPKP-X的生物學(xué)活性提供了重要的線索。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種從廣西纓毛蛛粗毒中制備新型生物活性多肽的方法，所述的生物活性多肽為蜘蛛抑鉀肽-X (spkp-χ)，其氨基酸序列為:NH2-Leu Cys Ser Arg Glu Gly Glu Phe Cys Tyr Lys Leu Arg Lys Cys Cys AlaGly Phe Tyr Cys Lys Ala Phe Val Leu His Cys Tyr Arg Asn-OH02.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從廣西纓毛蛛粗毒中制備新型生物活性多肽的方法，其特征在于，所述的蜘蛛抑鉀肽-X的N端第I位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之間，N端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之間，N端第15位半胱氨酸和第28位半胱氨酸之間分別形成二硫鍵。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述方法包括: Cl)①將粗毒干粉用雙蒸水溶解配成5mg/mL的毒素溶液，12 OOOrpm離心5 min,置于4°C保存；粗毒上樣陽離子交換HPLC進(jìn)行第一步分離；采用Waters 650型HPLC、美國Pharmacia公司的Hiprep?16/10 CM FF預(yù)裝柱進(jìn)行分離；486檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長為215nm ;流動(dòng)相為四相洗脫系統(tǒng)，流速為3 mL/min ;洗脫液分別為A相0.1M磷酸二氫鈉，B相0.1M磷酸氫二鈉，C相IM氯化鈉，D相雙蒸水(ddH20);其中A液和B液用來調(diào)節(jié)洗脫液的PH值，采用氯化鈉梯度洗脫；上述經(jīng)陽離子交換HPLC分離后收集的各洗脫峰分別上樣反相HPLC進(jìn)行進(jìn)一步純化；(2)反相高效液相色譜分離脫鹽純化:在Pharmacia公司的AKTA蛋白純化系統(tǒng)上完成，采用大連依利特公司的C18反相制備柱；③第三步采用分析型Vydac C18 RP-HPLC反相柱(218TP54, 4.6X250 mm)于分析型Waters 2690 高效液相色譜儀上進(jìn)行梯度洗脫，996檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長為280nm，流動(dòng)相為含0.1%TFA的水(A)和乙腈(B)，洗脫速度為lmL/min，柱溫為40°C ； (2)通過上述陽離子交換HPLC以及兩步反相HPLC共三步分離獲得的SPKP-X，運(yùn)用質(zhì)譜鑒定純度達(dá)到98%以上，其分子量約為3706.2 Da，經(jīng)序列測(cè)定，該多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)由31個(gè)氨基酸殘基組成，其中含6個(gè)半胱氨酸并形成三對(duì)二硫鍵；多肽SPKP-X純化凍干粉的理化性狀為白色或類白色疏松體，無氣味，極易溶解于水，水溶液近于無色透明。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備新型生物活性多肽的方法，得到的這種新型生物活性多肽，名稱為蜘蛛抑鉀肽-X（SPKP-X），是通過陽離子交換HPLC以及兩步反相HPLC共三步分離獲得，其一級(jí)結(jié)構(gòu)由31個(gè)氨基酸殘基組成，其中含6個(gè)半胱氨酸并形成三對(duì)二硫鍵，分子量為3726.2Da，該多肽純化凍干粉的理化性狀為白色或類白色疏松體，無氣味，極易溶解于水，水溶液近于無色透明。
【IPC分類】C07K14/435, C07K1/18, C07K1/20
【公開號(hào)】CN104987372
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510396410
【發(fā)明人】鄧梅春, 羅旋
【申請(qǐng)人】長沙沁才生物科技有限公司
【公開日】2015年10月21日
【申請(qǐng)日】2015年7月8日