一種砷-IgA螯合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及檢測(cè)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，設(shè)及一種神-IgA馨合物及其制備方法和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] IgA主要由粘膜相關(guān)淋己樣組織產(chǎn)生，其中大部分是由胃腸淋己樣組織所合成，少 部分由呼吸道、唾液腺和生殖道粘膜組織合成。哺乳期產(chǎn)婦腺組織含有大量IgA產(chǎn)生細(xì)胞， 該些細(xì)胞主要來(lái)自胃腸。在人類，還有少量的IgA來(lái)自骨髓。人出生后4~6月開始合成 IgA,4~12歲血清中含量達(dá)成人水平，血清型IgA總Ig的10%左右，半衰期約5~6天。 IgA有IgAl和IgA2兩個(gè)亞類。IgAl主要存在于血清中，約占血清中IgA的85%，a1鏈分 子量為56kD;IgA2主要存在于外分泌液中，少部分W血清型IgA存在，約占血清中IgA的 15%，a2鏈缺乏較鏈區(qū)，分子量為52kD。血清中的IgA除單體形式外還有由J鏈共價(jià)相連 的二聚體或=聚體等形式。分泌型IgA是由J連接的雙體和分泌成分所組成，主要存在于 初乳、唾液、淚液、胃腸液、支氣管分泌等外分泌液中，是粘膜局部免疫的最重要因素，分泌 型IgA通過(guò)與相應(yīng)的病原微生物（如脊髓灰質(zhì)炎病毒）結(jié)合，阻抑其吸附到易感細(xì)胞上，分 泌型IgA還可中和毒素如霍亂弧菌毒素和大腸桿毒素等。新生兒易患呼吸道、胃腸道感染 可能與IgA合成不足有關(guān)。慢性支氣管炎發(fā)作與分泌型IgA的減少也有一定關(guān)系。產(chǎn)婦可 通過(guò)初乳將分泌型IgA傳遞給嬰兒，該也是一種重要的自然被動(dòng)免疫。嗜酸性粒細(xì)胞、中性 粒細(xì)胞和巨瞻細(xì)胞表達(dá)化aR，血清型單體IgA可介導(dǎo)調(diào)理吞瞻和ADCC作用。此外，分泌 型IgA具有免疫排除功能，即分泌型IgA結(jié)合飲食中大量的可溶性抗原W及腸道正常菌群 或病原微生物所釋放的熱原物質(zhì)，防止它們進(jìn)入血液。
[0003] 眾所周知，神（Asckel，As)與人體的健康息息相關(guān)，首先其是人體維持健康所必 需的微量元素，其存在于多種氨化酶中，催化氨的氧化還原反應(yīng)，參與多種酶蛋白的合成和 細(xì)胞激素及色素的代謝，具有促進(jìn)鐵的吸收和紅細(xì)胞的增長(zhǎng)、激活酶形成輔酶、增強(qiáng)膜島 素、降血糖、保護(hù)屯、血管等作用，因此如果人體缺乏神，會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生。但是，事實(shí)在生 活中，由于環(huán)境污染，人體內(nèi)很少缺乏神，相反神的含量常常過(guò)量，常常導(dǎo)致疾病的發(fā)生，甚 至危及生命。
[0004] 神在體內(nèi)的含量超過(guò)一定水平就會(huì)對(duì)健康引起難W恢復(fù)的損害，它可W神煙，神 塵和各種氧化物形式被人體經(jīng)呼吸道和消化道攝入體內(nèi)，通過(guò)與巧離子的競(jìng)爭(zhēng)作用，氧化 損傷，細(xì)胞調(diào)亡等機(jī)制，引起W神經(jīng)、消化、造血系統(tǒng)障礙為主的全身性、漸進(jìn)性、持久性不 可逆性疾病，而且其危害還可能遺傳到下一代。貧血是神中毒的早期癥狀之一，神可抑制血 紅素合成過(guò)程中許多酶的活性。神中毒可致血管疫李、腹絞痛、視網(wǎng)膜小動(dòng)脈疫李和高血 壓，時(shí)常導(dǎo)致細(xì)小動(dòng)脈硬化。神的腎損害常表現(xiàn)為間質(zhì)性腎炎或萎縮性腎炎等病變，腎小管 重吸收功能下降是早期的癥狀。神接觸還可能影響生殖功能，接觸神的女性發(fā)生不孕癥、流 產(chǎn)及死胎的機(jī)率增多，并可通過(guò)胎盤轉(zhuǎn)移到胎兒身上。經(jīng)口神中毒者肝臟為主要受損器官 之一，可引起肝腫大呈現(xiàn)黃痘，甚至肝硬變或肝壞死，肝損害可能是肝內(nèi)小動(dòng)脈疫李引起 局部缺血所致。神引起化咐代謝障礙、抑制含琉基酶，干擾植物神經(jīng)。
[000引神與多種蛋白質(zhì)之間關(guān)系密化可W與多種蛋白質(zhì)結(jié)合，抑制多種蛋白酶的活性。 隨著對(duì)神毒性研究的深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到神與蛋白的相互作用在其致毒過(guò)程中扮演著重 要的角色，被認(rèn)為是了解神的毒性機(jī)理的關(guān)鍵所在，因此，對(duì)神和蛋白質(zhì)相互作用的研究就 顯得愈發(fā)重要。而現(xiàn)在關(guān)于神與蛋白質(zhì)作用的機(jī)理僅是冰山一角，還有很多蛋白質(zhì)與神之 間的關(guān)系還不清楚，因而加強(qiáng)對(duì)于神與蛋白質(zhì)之間的關(guān)系至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)神污染嚴(yán)重的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種神-IgA馨合物及其制備方 法，并建立神-IgA馨合物的定性、定量檢測(cè)方法，W便定量檢測(cè)神-IgA馨合物在評(píng)價(jià)一個(gè) 地區(qū)神污染程度的應(yīng)用。通過(guò)定量檢測(cè)一個(gè)地區(qū)人群血清中神-IgA馨合物可W間接反映 該個(gè)地區(qū)人群受神污染的情況，從而間接反映該個(gè)地區(qū)神污染程度。
[0007] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是；提供一種神-IgA馨合物，神離子與 IgA通過(guò)琉基或/和半脫氨酸殘基馨合而成。
[000引本發(fā)明還提供一種上述的神-IgA馨合物的制備方法，包括W下步驟：
[0009] A)神與IgA的馨合反應(yīng)；在提純?cè)从谌梭w的IgA或按照生物學(xué)方法重組的IgA中 加入神離子進(jìn)行馨合反應(yīng)，得到反應(yīng)溶液；
[0010] B)純化神-IgA馨合物的提??；采用免疫親和層析法，去除反應(yīng)溶液中未反應(yīng)的 IgAW及多余的神離子，即得神-IgA馨合物。
[0011] 其中，體外合成法中所述步驟B)具體如下；
[0012] (1)溶解樣品；向經(jīng)過(guò)步驟A)得到的反應(yīng)溶液中加入生理鹽水使神-IgA馨合物 復(fù)溶；
[001引似平衡層析柱；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與IgA特 異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0014] 做上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)中樣品，然后上柱，IgA與 填料特異性結(jié)合；
[0015] (4)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0.Imol/L的磯 酸鹽溶液進(jìn)行洗脫，得到洗脫液I;
[0016] (5)收集；收集洗脫液I;
[0017] (6)透析；將步驟巧）中的收集的洗脫液，裝透析袋，用d地2〇透析除鹽，換水S次 后，4°C透析過(guò)夜，收集樣本；
[0018] (7)平衡層析柱；采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與神特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0019] 做上樣；待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟做中樣本，然后上柱；
[0020] (9)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的磯 酸鹽溶液進(jìn)行洗脫，得到洗脫液II;
[0021] (10)收集；收集洗脫液II;
[002引 （11)透析；將步驟（10)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用(1化0透析除鹽，換水立 次后，4°C透析過(guò)夜，收集樣本，即得神-IgA馨合物。
[0023] 其中，上述神-IgA馨合物的制備方法，還包括步驟C);對(duì)神-IgA馨合物的鑒定；
[0024] 其中，步驟C)中具體如下：
[0025] (1)制備膠床；W瓊脂糖凝膠、聚丙締酷胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床；
[0026] 似加樣；取步驟B)中提取純化得到的神-IgA馨合物，加入稀釋緩沖液，并混勻， 然后加樣于樣品槽中；
[0027] 做電泳：連接電泳板，進(jìn)行電泳；
[002引 （4)檢測(cè)；在膠床上找出含神的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法檢測(cè)是否含有神W及檢測(cè)神的含量。
[0029] 本發(fā)明還提供一種如上述的神-IgA馨合物在制備檢測(cè)人體內(nèi)神-IgA馨合物的試 劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0030] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的神-IgA馨合物作為標(biāo)準(zhǔn)品的試劑盒。
[0031] 優(yōu)選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液含有捕獲IgA的物質(zhì)或捕獲神的物 質(zhì)。
[0032] 本發(fā)明還提供一種定量檢測(cè)神-IgA馨合物的方法，W已知含量的上述的神-IgA 馨合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用W下方法之一對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)；酶聯(lián)免疫法、酶聯(lián)免疫與原子吸收 光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純神-IgA馨合物與酶聯(lián)免疫結(jié) 合法、提純神-IgA馨合物與原子吸收光譜結(jié)合法、提純神-IgA馨合物與電感禪合等離子體 質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原子吸收光譜或電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
[0033] 實(shí)施本發(fā)明的神-IgA馨合物及其制備方法和應(yīng)用，具有W下有益效果：
[0034] 1.本發(fā)明首次體外合成神-IgA馨合物；
[0035] 2.本發(fā)明首次提出神-IgA馨合物可用于制備檢測(cè)血樣中神-IgA馨合物的試劑或 試劑盒中的應(yīng)用。
[0036] 3.本發(fā)明建立了神-IgA馨合物的定性定量檢測(cè)方法，W便定量檢測(cè)神-IgA馨合 物在評(píng)價(jià)一個(gè)地區(qū)神污染程度的應(yīng)用。通過(guò)定量檢測(cè)一個(gè)地區(qū)人群血清中神-IgA馨合物 可W間接反映該個(gè)地區(qū)人群受神污染的情況，從而間接反映該個(gè)地區(qū)神污染程度。本發(fā)明 建立的神-IgA馨合物定量檢測(cè)方法其準(zhǔn)確度大大提高，并且使檢測(cè)的重復(fù)性得到大大提 局。
【附圖說(shuō)明】
[0037] 圖1為本發(fā)明所述的神-IgA馨合物的非變性電泳條帶圖；
[003引圖2為本發(fā)明所述的神-IgA馨合物的電泳條帶的同步福射X線巧光分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 下面，結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
[0040] 本發(fā)明除特別說(shuō)明外，設(shè)及的實(shí)驗(yàn)操作步驟均為本領(lǐng)域常規(guī)的步驟，所用試劑、材 料如下述所列舉，在本發(fā)明中沒(méi)有列舉出來(lái)的均為本領(lǐng)域常用的試劑或可W通過(guò)市購(gòu)方式 獲得：
[004^ 磯酸鹽溶液為0. 05-0.Imol/L化2冊(cè)04溶液或0. 5-lmol/L化2冊(cè)04溶液；
[0042] 提取試劑為PEG溶液、棚酸鹽緩沖液等（采用PEG法）；
[0043] 膠床介質(zhì)為瓊脂糖凝膠、聚丙締酷胺凝膠中的一種；
[0044] 捕獲IgA的物質(zhì)購(gòu)買自艾美捷科技有限公司的型號(hào)為Abeam油8508的兔Anti-人 類IgAH&L;其中，本發(fā)明所述與IgA特異性結(jié)合的物質(zhì)、抗IgA抗體、IgA抗均為捕獲IgA 的物質(zhì)；
[0045] 捕獲神的物質(zhì)購(gòu)買自廣州然科生物科技有限公司的型號(hào)為服15728的鼠抗As mAb;其中，本發(fā)明所述與神特異性結(jié)合的物質(zhì)、抗As抗體、抗神抗體、神抗均為捕獲神的物 質(zhì)；
[0046] 酶標(biāo)抗體為含有辣根過(guò)氧化物酶、堿性磯酸酶等酶標(biāo)記的抗體中的一種；
[0047] 底物為甲基聯(lián)苯胺（TMB)溶液；
[0048] 洗漆液為含有