抗cd20的全人源單克隆抗體及其應用
【專利說明】
[0001] 本申請是分案申請，其原申請的申請?zhí)枮?01210082298. 6,申請日為2012年3月 26日，發(fā)明名稱為"抗CD20的全人源單克隆抗體及其應用"。
技術領域
[0002] 本發(fā)明設及抗體藥物的技術領域。具體地說，設及一組全人源單克隆抗體新分子， 其可用于淋己瘤的診斷和治療。
【背景技術】
[0003] 1.CD20
[0004] CD20是一種分子量為33~37kDa的非糖基化磯蛋白，有4個跨膜區(qū)，氨基端和駿 基端都位于細胞質膜內側，在第=跨膜區(qū)和第四跨膜區(qū)之間，有一個由43個氨基酸殘基組 成的環(huán)區(qū)，構成其主要的抗原表位。作為B淋己細胞表面分化抗原，它起始表達于pre-B細 胞階段，到B細胞終端分化成漿細胞時結束，一直被認為是B系細胞表面特有的標識。它主 要參與調節(jié)B淋己細胞的增殖與分化，在免疫系統(tǒng)起重要作用。80%~85%的非霍奇金氏 淋己瘤（饑正）為B細胞來源，并且該些細胞的約95%均有表面CD20表達CD20的表達 因淋己瘤細胞的不同而有所差異，濾泡性淋己瘤細胞表面表達較高，小細胞淋己瘤白血病 細胞表面表達較低，在干細胞和漿細胞中不表達，慢性B淋己白血病細胞中的表達遠低于 正常的B細胞和其他B淋己瘤細胞，CD20的表達高低在一定程度上決定了抗體和補體殺傷 瘤細胞的程度?。單核細胞、靜息W及激活的T細胞、裸細胞W及非淋己細胞都不表達CD20 分子。CD20與抗CD20抗體結合后內化現(xiàn)象不明顯，細胞表面CD20分子數(shù)量并不因為與抗 體結合而大量減少，CD20也不會發(fā)生明顯細胞表面脫落的現(xiàn)象，因此，CD20是免疫治療B細 胞淋己瘤的理想作用位點，特別是對治療惰性、復發(fā)難治性B細胞淋己瘤有較肯定的療效。
[0005] 2.治療性抗CD20抗體
[0006] 抗CD20治療可清除惡性B細胞和部分正常B細胞，但由于干細胞和B細胞前體不 表達CD20,因而不會造成長期B細胞損耗。其臨床應用主要適應證為；1.單純應用抗CD20 單克隆抗體治療濾泡性B細胞型非霍奇金淋己瘤；2.抗CD20單克隆抗體與化療聯(lián)合應用 治療彌漫大B細胞型淋己瘤及慢性B淋己細胞白血病炬-化L)。
[0007]2. 1I?i1:uximab(美羅華）
[0008]IDEC-C2B8,又名化化ximab，商品名為美羅華，1997年由抑A批準上市，是第一個 被美國FDA批準用于治療腫瘤的單克隆抗體W。它是一個人鼠嵌合抗體，包含鼠源抗CD20 單克隆抗體2B8(Ibritumom油）的可變區(qū)和人源IgGl重鏈及K鏈的恒定區(qū)，用于B細胞淋 己瘤的治療。Rituximab在體內通過抑制細胞增殖或觸發(fā)多種細胞破壞機制，包括抗體依賴 性細胞毒作用（ADCC)和補體依賴性細胞毒作用（CDC)W及細胞調亡發(fā)揮明顯的抗腫瘤功 效W。近年的臨床研究證實，該藥治療譜較廣，對B淋己細胞性疾病均可取得較好的療效。
[0009] 2. 2ZEVALIN
[0010] 2002年2月，抑A批準了第一個放射性免疫治療藥物Zevalin。該藥由IDEC制藥 公司生產，通用名扣ritumom油Tiuxetan。FDA批準此藥用于治療復發(fā)性或難治性低惡性 度/濾泡性或轉化的B細胞饑正，其中包括化tuximab難治性的濾泡性NHL。該產品由小鼠 IgGl-K單克隆抗體2B8abritumomab)連接同位素9°Y用于腫瘤治療。其單抗部分對CD20 具有高的特異親和性W。
[00"] 2. 3 邸XXAR
[0012] 2003 年 6 月 27 日，F(xiàn)DA批準Bexxar(Tositumom油和nijTositumom油）用于治療 癌細胞已經或未發(fā)生轉移、對化化ximab有耐藥性、化療后又復發(fā)的CD20陽性濾泡性饑正。 它由鼠源單克隆抗體一抗B1單克隆抗體（Tositumomab，IgG2a-A)與放射性同位素"4共 價偶聯(lián)而成。
[0013] 2. 4ARZERA
[0014] 2009年10月26日，F(xiàn)DA批準ARZERA(Ofatumum油）用于治療慢性淋己細胞性白血 病（化L)。它由KM人源轉基因鼠免疫通過雜交瘤技術產生的人單克隆抗體。和化化ximab 相似其在體內通過抑制細胞增殖或觸發(fā)多種細胞破壞機制，包括抗體依賴性細胞毒作用 (ADCC)和補體依賴性細胞毒作用（CDC)W及細胞調亡發(fā)揮明顯的抗腫瘤功效。但其在治療 非霍奇金氏淋己瘤（NHL)的S期臨床試驗失敗。目前其主要用于對一線化療藥物耐受的慢 性淋己細胞性白血病。
[0015] 3.化化ximab在臨床的應用
[0016] 3. 1單獨應用治療非霍奇金氏淋己瘤（NHL)
[0017] 化化ximab可單獨應用，推薦的使用劑量是每周375毫克/平方米，靜脈內注射， 共4次，治療復發(fā)或耐藥性低度惡性CD20陽性B細胞NHL;II期臨床試驗表明，總體有效率 為48%，其中6%為完全有效，42%為部分有效，緩解期通常為1年。對于初治的低度惡性 饑正，單藥有效率為50%~70%左右，維持治療能夠進一步提高療效。副作用較溫和，可隨 抗體輸入量的減少而減輕，治療中沒有或少有感染并發(fā)癥發(fā)生。因而化化xim油作為一線 藥物應用治療饑正已有著無法替代的作用。
[0018] 2004年，歐盟許可化化xim油聯(lián)合標準化療W治療侵襲性饑正。一些臨床試驗用 來評估化化xim油單獨或聯(lián)合治療惰性、侵襲性饑正和其他一些B細胞淋己組織增生素亂。 化tuxim油對類風濕性關節(jié)炎、免疫性血小板減少性紫藏、免疫性溶血性貧血、系統(tǒng)性紅斑 狼瘡和多發(fā)性硬化等自身免疫素亂性疾病的作用也在研究中W。
[0019] 3. 2聯(lián)合化療治療B細胞淋己瘤
[0020] 徐志巧等W應用同期對照的前瞻性研究方法，將22例B細胞性饑正患者分為研 究組巧ituxim油組）和對照組，研究組11例用CHOP方案（環(huán)磯酷胺、多柔比星、長春新堿 和潑巧松）聯(lián)合化化xim油治療；對照組11例單用CHOP方案。結果化化xim油組完全緩 解率（CR)達72. 7%巧/II)，總有效率90. 9% (10/11);對照組CR為36. 4% (4/11)，總有 效率為54. 6% (6/11)，兩組療效差異有統(tǒng)計學意義。初步研究結果提示，化化xim油聯(lián)合 CHOP方案治療CD20陽性的B細胞性饑正的療效顯著，不良反應與單純化療相似，可作為該 病目前的首選方案。
[0021] 3. 3在風濕性疾病治療中的應用
[0022] 類風濕關節(jié)炎（rheumatoidart虹itis，RA)是一種W滑膜炎為主要病理改變的全 身性自身免疫病，W慢性破壞性關節(jié)病變?yōu)樘卣?。B細胞是類風濕因子（RF)、抗瓜氨酸抗體 (抗CCP)等自身抗體的主要來源細胞，同時研究表明RA滑膜中T細胞活化主要依賴于B細 胞抗原呈遞作用?，是RA等自身免疫病發(fā)病機制核屯、環(huán)節(jié)之一。
[0023] Edwards等nw報道了161例大樣本的隨機雙盲對照研究，試驗分為口服甲氨蝶 嶺組（>lOmg/ 周）、I?i1:uximab組（Igdl，dl5)、I?i1:uximab聯(lián)用環(huán)磯酷胺組（750mgd3， dl7)、化化ximab聯(lián)用甲氨蝶嶺組，結果顯示，化化xim油治療組24周后達到ACR2065%~ 76%，單用甲氨蝶嶺治療組為38%，兩者比較有顯著性差異（P<0. 025);持續(xù)觀察48周， 化化xim油治療組療效（ACR2033%~65% )與單用甲胺蝶嶺組（ACR2020% )相比仍有顯 著性差異（P《〇. 01)。在治療第24周達AC貼0緩解的患者，單用化化xim油組（33%)、聯(lián)用 甲氨蝶嶺組（43%)、聯(lián)用環(huán)磯酷胺組（41%)均高于甲氨蝶嶺組（13%)。此外，Rituximab 治療組患者的RF水平迅速下降。且24周內維持較低水平。而單用甲氨噪嶺組RF水平僅 一過性輕度下降。該試驗化化ximab療效與B細胞清除情況相關，證明了化化ximab在RA 中的治療作用W及B細胞在RA發(fā)病中的重要作用。針對化化xim油對RA的治療作用的一 系列研究也表明化化xim油治療RA療效穩(wěn)定，是生物治療的新途徑。
[0024] 3. 4對系統(tǒng)性紅斑狼瘡的治療作用
[0025] 系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemiclupuse巧thematosus,SLE)是多系統(tǒng)受累、W多種自 身抗體表達的自身免疫性疾病。B細胞在SLE發(fā)病機制中發(fā)揮了關鍵性作用；分泌大量致 病性自身抗體和白介素10 (比-10)、白介素6 (IL-6)、腫瘤壞死因子（TNF-丫）等多種細胞因 子；高選擇性的抗原呈遞作用，將抗原呈遞給T細胞，同時刺激調節(jié)T細胞、樹突狀細胞活化
[11] 〇
[0026]Loon巧等哉道了 17例化化xim油治療SLE的I/II期擴大臨床試驗，均為 活動性狼瘡。大部分患者同時接受免疫抑制劑治療。分為=組接受低、中、高不同劑量的 化化ximab，分別為100mg/m2、275mg/m2、375mg/m2每周1次、共4周。結果表明疾病控制與B 細胞清除情況有關。11例B細胞清除（CD19陽性細胞巧M)患者皮疹、發(fā)熱、關節(jié)痛等臨 床癥狀可緩解。系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動評分（SLAM)多在用藥2~3個月時緩解，持續(xù)12個 月。
[0027] 初步臨床研究證明化化xim油治療SLE是可行的，其療效和安全性期待大樣本臨 床研究。
[0028] 3. 5化化xim油治療小兒免疫性血小板減少性紫藏
[0029]免疫性血小板減少性紫藏（immunologict虹omboc}ftopenicpu;rpura，口巧是一 種自身免疫性出血性疾病。目前研究證明，ITP患者T淋己細胞調節(jié)素亂，導致B淋己細胞 功能素亂，產生針對自身血小板的IgG抗體，進而使血小板破壞增多。文獻報道化化ximab 可快速持久地清除循環(huán)中的B淋己細胞，減少自身抗體的產生，從而減少血小板的破壞。 Taube等叫吏用化化xim油治療了 22例慢性ITP患兒，在化化xim油用后的1~2周外周 血CD20陽性B淋己細胞呈明顯下降，2~3個月后逐漸恢復正常。結果7例完全緩解，6例 部分緩解，5例復發(fā)，反應率為59% (13/22)，復發(fā)率為38%巧/13)，持續(xù)緩解的時間是2~ 16個月。石淑文等M用化化xim油治療了 3例小兒慢性/難治性口P，3例均為聯(lián)合用 藥，1例聯(lián)合阿賽松治療部分緩解，治療后患兒血小板持續(xù)維持相對較高的水平達18個月 之久，且不再需要IVIG沖擊治療，阿賽松逐漸減量至停用，余兩例分別聯(lián)合了大劑量IVIG、 班巧酸氨化考的松和長春新堿，治療后血小板有短暫的回升（分別是21天和11天），但很 快又降至同入院前的低水平且持續(xù)不見回升，認為短暫的血小板回升可能是大劑量IVIG、 班巧酸氨化考的松或長春新堿的作用，為不緩解病例。上述結果表明化tuxim油對ITP有 較好的治療作用，能夠快速持久地清除循環(huán)中的B淋己細胞，減少自身抗體的產生，從而減 少血小板的破壞，可作為臨床用藥。但部分病例該種清除是暫時的，停用化化xim油后循 環(huán)中的B淋己細胞又會恢復，該可能和部分病人再次復發(fā)有關。關于化化xim油治療慢性 /難治性ITP的總反應率成人為23~75 % ^53，兒童為66 %，基本相同。
[0030] 4.人源抗體的制備
[0031] 20世紀70年代中期雜交瘤技術問世，由此制備出的單克隆抗體（MAb)是抗單一抗 原決定簇的抗體，具有高度的特異性和均一性，且能大量制備，該成為抗體研究領域的一次 重大革命。1986年，應用此技術制備的第一個單克隆抗體藥物OKT3被美國抑A批準上市， 被用于治療器官移植后的免疫排斥。但由于抗體是鼠源的，在病人中引發(fā)了嚴重的免疫反 應，該就大大阻礙了抗體藥物的發(fā)展和利用。
[0032] 隨著抗體被用來開發(fā)成藥物，它的一些特征也將被嚴格考量，像免疫原性、親和 力、穩(wěn)定性、效應功能、半衰期、組織滲透性及其分布等bu。在鼠源MAb生產變得成熟時，研 究者便預想通過常規(guī)的雜交瘤技術生產人源MAb，但由于人雜交瘤細胞系不能穩(wěn)定的生產 高產量的抗體，并且對于很多抗原來說，人的體內免疫是不可行的。該樣，基因工程抗體由 然而生，1994年，第一個嵌合抗體ReoPro獲準上市，臨床應用表明其免疫原性遠優(yōu)于鼠源 抗體，該就掀起了繼雜交瘤單克隆抗體之后抗體工程研究領域的又一次革命。特別是90年 代中期W來，為進一步降低免疫反應的發(fā)生，多種人源化改造技術被成功開發(fā)并得W應用， 各種各樣的基因工程抗體及抗體庫不斷出現(xiàn)使得大規(guī)模生產醫(yī)用人源化抗體成為 可能。從1997年開始，大批的單抗藥物被抑A批準上市。
[0033] 單抗人源化改造技術的應用打破了抗體藥物產業(yè)化的瓶頸。迄今，按照人源化 程度的高低大體可分為=種技術：嵌合、人源化和全人源，其基因中人源序列占比分別為 75%、95%和100% 其中嵌合抗體是將鼠雜交瘤單克隆抗體基因的可變區(qū)和人的恒定 區(qū)連接在一起，然后在哺乳動物細胞中進行表達產生；而人源化抗體則是除了將抗體的恒 定區(qū)換成人源的之外，更進一步的將可變區(qū)的FR區(qū)轉換成人源的bw，從而降低免疫原性； 而全人源抗體制備則是有四種途徑，一種從采集的