高耐受性β-葡萄糖苷酶及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種高耐受性0-葡萄糖巧酶及其應(yīng)用，屬于發(fā)酵工程與生物技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[000引 0 -葡萄糖巧酶（0-Glucosidase，EC3. 2. 1. 21)，又稱0-D-葡萄糖巧水解酶，它 能夠水解結(jié)合于末端非還原性的0-D-葡萄糖巧鍵，同時(shí)釋放出0-D-葡萄糖和相應(yīng)的配 基，該種酶存在于許多植物體，還存在于一些酵母、霉菌、木霉菌屬及細(xì)菌甚至是昆蟲體內(nèi)。 0-葡萄糖巧酶可W將水果、蔬菜、茶葉中的風(fēng)味前體物質(zhì)0-糖巧水解為具有濃郁天然風(fēng) 味的香氣物質(zhì)。
[0003] 0-葡萄糖巧酶的可運(yùn)用領(lǐng)域廣泛：可W用在果汁行業(yè)用于增香脫苦，很多果汁 中含有很多風(fēng)味前體物質(zhì)一一 0 -糖巧，只要通過一些酶的作用就能使該些糖巧配基揮發(fā) 釋放，起到增香的作用，在眾多的研究中發(fā)現(xiàn)，棘抱曲霉產(chǎn)的葡萄糖巧酶對(duì)蘋果汁、巧樣汁、 茶汁的增香效果良好；另外在果酒中的增香目前也是研究的熱點(diǎn)，對(duì)于脫苦的原理和增香 類似，例如在青梅汁中，葡萄糖巧酶可W將其中的苦杏仁巧分解為苯甲醒及氨氯酸和兩分 子的葡萄糖，該就使青梅的苦味大大減少；葡萄糖巧酶的脫苦還可W用在巧橘、橄攬等具有 一定苦味的水果中。
[0004] 另外，還可W用于一些糖巧類前體的分解來生產(chǎn)分解后產(chǎn)物，例如低聚龍膽糖的 生產(chǎn)、大豆異黃酬的生產(chǎn)，該兩種產(chǎn)物的前體都是W結(jié)合型的糖巧形式存在。除了W上該些 領(lǐng)域，0-葡萄糖巧酶的應(yīng)用領(lǐng)域還很寬泛，比如制造生物酒精，通過基因技術(shù)來達(dá)到防治 病蟲害的目的，W及一些天然染料的生產(chǎn)，動(dòng)物飼料的生產(chǎn)甚至是醫(yī)藥領(lǐng)域。
[0005] 目前，國內(nèi)外對(duì)于0-葡萄糖巧酶的研究不少，但現(xiàn)有技術(shù)中產(chǎn)0-葡萄糖巧酶的 棘抱曲霉菌株胞外0-葡萄糖巧酶活性不高，所獲得的0-葡萄糖巧酶的耐受性不佳，如不 耐高溫、高酒精度、高鹽和高醋酸環(huán)境，導(dǎo)致其應(yīng)用領(lǐng)域受限，本申請(qǐng)的發(fā)明人獲得一株具 有較高胞外0-葡萄糖巧酶活性的棘抱曲霉菌株，發(fā)酵獲得的0-葡萄糖巧酶能耐高溫、耐 高酒精度、耐高鹽和高醋酸環(huán)境，應(yīng)用領(lǐng)域廣泛。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種由具有較高胞外0 -葡萄糖巧酶活性的棘抱曲霉菌 株發(fā)酵獲得的0-葡萄糖巧酶，該0-葡萄糖巧酶能耐高溫、耐高酒精度、耐高鹽和高醋酸 環(huán)境。
[0007] 本發(fā)明另一個(gè)目的是提供該棘抱曲霉菌株發(fā)酵產(chǎn)生的0-葡萄糖巧酶的若干應(yīng) 用。
[0008] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是； 高耐受性0-葡萄糖巧酶，所述0-葡萄糖巧酶耐65-100°C高溫，耐質(zhì)量濃度4~6%的 氯化鋼，耐質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的醋酸，耐體積分?jǐn)?shù)11%W上的酒精，該0 -葡萄糖巧酶由保藏編號(hào) 為CGMCCNo. 7799、保藏名稱為曲霉Uwer知Wusw. )BG30的棘抱曲霉菌株發(fā)酵獲得，其 制備方法按如下步驟進(jìn)行： (1) 將曲霉（知Wus5/7. )BG30接入斜面培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)，用無菌生理鹽水 洗下斜面培養(yǎng)基上的抱子； (2) 將抱子液接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液進(jìn)行分離獲得0 -葡萄糖巧酶 粗酶液，所述粗酶液經(jīng)過鹽析、透析、DEAE-陰離子交換柱層析、脫鹽和冷凍干燥純化獲得 0-葡萄糖巧酶。
[0009] 曲霉（AspergillusSP. )BG30,保藏單位；中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微 生物中屯、，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)CGMCCNo. 7799,保藏日 期2013年6月28日。
[0010] 曲霉Uwer知Wus )BG30的菌落形態(tài)特征；在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上生長快， 25°C黑暗條件下培養(yǎng)7天，菌落直徑60-65mm，質(zhì)地絨狀；產(chǎn)抱結(jié)構(gòu)大量形成，分生抱子頭紫 褐色，初期球形，后期開裂，菌落背面淺褐色。分生抱子梗大，寬8. 5-11. 0ym，褐色，壁光滑， 頂囊球形，直徑33-42ym，全部表面可有；產(chǎn)抱結(jié)構(gòu)單層，瓶梗6-10*ym，分生抱子楠圓形， 少數(shù)球形或近球形，淺到褐色，具明顯小刺，2. 9-4. 7*2. 5-4. 0ym，未見有性抱子。
[0011] 培養(yǎng)條件影響曲霉Uwer知)BG30的繁殖，進(jìn)而影響其生產(chǎn)0 -葡萄糖 巧酶的能力，步驟（1)中增殖培養(yǎng)的條件為溫度28~30°C，培養(yǎng)時(shí)間96~120h;步驟（2)中發(fā) 酵培養(yǎng)的條件為溫度28~30°C，培養(yǎng)時(shí)間96~120h。
[001引 0 -葡萄糖巧酶作為胞外產(chǎn)物，發(fā)酵完成后，0 -葡萄糖巧酶存在于發(fā)酵液中，通 過常規(guī)的酶分離純化方法即可分離純化獲得高酶活的0-葡萄糖巧酶。
[0013] 培養(yǎng)基的種類也是影響棘抱曲霉菌株繁殖的重要條件，步驟（1)中斜面培養(yǎng)基的 組成為；葡萄糖5.Og，氯化鋼3.Og，硝酸鐘3.Og，磯酸氨二鐘0. 06g，硫酸銅0. 004g，款皮 10.Og，酒石酸鐘鋼0. 005g，氯化鐵0. 005g，硫酸鋪0. 005g，瓊脂20.Og，乳糖10.Og，蒸饋水 1000血，抑值5. 5~6. 0,所述斜面培養(yǎng)基配置好后于0. 08Mpa滅菌20min，劃線接入曲霉 BG30進(jìn)行培養(yǎng)。
[0014] 步驟（2)中產(chǎn)酶培養(yǎng)基的組成W1L培養(yǎng)基計(jì)為；款皮34~36g，硫酸錠1. 8~2.Og， M拆〇4 ? 7&0 0. 4~0. 5g，蛋白腺 1. 2~1. 5g，F(xiàn)eS〇4 ? 7&0 0. 008~0.Olg，葡萄糖 2g，抑 5. 45~5. 55。
[0015] 本發(fā)明的高耐受性0-葡萄糖巧酶的應(yīng)用，在催化葡萄糖和抗環(huán)血酸合成抗壞 血酸葡萄糖巧中的應(yīng)用，催化葡萄糖和抗環(huán)血酸合成抗壞血酸葡萄糖巧的具體工藝為：每 lOOmLW水做溶劑的反應(yīng)體系中加入3-6g抗環(huán)血酸、15-25g葡萄糖和Ig酶保護(hù)劑硫脈，再 按0. 01-0.lOU/mL的添加量加入酶，于55-65°C反應(yīng)2-2.化。
[0016] 本發(fā)明的高耐受性0-葡萄糖巧酶的應(yīng)用，在催化乳糖合成低聚0-半乳糖巧中 的應(yīng)用，催化乳糖合成低聚0-半乳糖巧的具體工藝為：每lOOmLW水做溶劑的反應(yīng)體系中 加入乳糖30-45g和酶穩(wěn)定劑硫脈Ig，再按0. 01-0.lOU/mL的添加量加入酶，于28-70°C反 應(yīng)5-10分鐘。
[0017] 本發(fā)明的高耐受性0-葡萄糖巧酶還可W用于楊梅酒、擲猴桃酒、半甜型擲猴桃 酒、干型擲猴桃酒、擲猴桃白蘭地酒的脫苦去澀，W及用于雜糧酒發(fā)酵增香、洋河大曲酒增 香、蓮子酒增香、茶葉增香；用于調(diào)料品增香或食品增香，W及用于化妝品或護(hù)膚品的增香。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是；本發(fā)明的高耐受性e-葡萄糖巧酶耐 65-100°C高溫，耐質(zhì)量濃度4-6%的氯化鋼，耐質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%醋酸和體積分?jǐn)?shù)11%W上的酒 精，具有較強(qiáng)的增香功能及轉(zhuǎn)糖巧酶活性，可W用作酶法合成烷基糖巧；還可W用于多種果 酒、白酒、調(diào)料品和食品的增香化及化妝品和護(hù)膚品的增香，應(yīng)用范圍廣，增香效果突出。
【附圖說明】
[0019] 圖1;分離純化并脫鹽凍干后0-葡萄糖巧酶的SDS-PAGE電泳銀染結(jié)果； 圖2 ;不同抑對(duì)發(fā)酵液粗酶液的0-葡萄糖巧酶活性的影響； 圖3 ;不同抑對(duì)精酶液的0-葡萄糖巧酶活性的影響； 圖4 ;溫度對(duì)發(fā)酵液粗酶液的0-葡萄糖巧酶活性的影響； 圖5 ;溫度對(duì)精酶液的0-葡萄糖巧酶活性的影響； 圖6 ; 0 -葡萄糖巧酶對(duì)pNPG的酶動(dòng)力學(xué)雙倒數(shù)圖； 圖7;酒精作用下0-葡萄糖巧酶對(duì)pNPG的酶動(dòng)力學(xué)雙倒數(shù)圖； 圖8 ; 0 -葡萄糖巧酶催化合成抗壞血酸葡萄糖巧反應(yīng)混合物薄層層析圖譜； 圖9;抗壞血酸葡萄糖巧合成過程還原糖濃度的變化； 圖10 ; 0 -葡萄糖巧酶催化乳糖合成低聚0 -半乳糖巧反應(yīng)混合物的薄層層析圖譜； 圖11 ;19°白酒的判別函數(shù)分析圖（LDA); 圖12 ;38°白酒的判別函數(shù)分析圖（LDA); 圖13 ;56°白酒的判別函數(shù)分析圖（LDA)。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面通過具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。
[0021] 1、菌株的分離純化 1. 1樣本采集：從小竹林排水溝、野生茶樹下、腐爛竹葉和枯桃樹木等下的±壤中采集 25個(gè)±壤樣品于無菌試管中。
[0022] 1. 2樣本處理 試劑準(zhǔn)備；含抗生素的樣本處理液配置：氨節(jié)青霉素Ig，卡那霉素〇.55g，氯化鋼 8. 5g，吐溫Ig溶于適量水中；Ig氯霉素用4. 5ml己醇溶解；將己醇-氯霉素溶液混入第一 步所得溶液中，定容至1L得到處理液。
[0023] 篩選培養(yǎng)基；含甲基紅的察氏培養(yǎng)基（肖/1);〔1(：-化15.0，硝酸鋼3.0g，^;：水硫酸 儀0. 5肖，氯化鐘0. 5g，^;：水硫酸亞鐵0.01肖，磯酸氨二鐘1.0肖，甲基紅0. 2肖，瓊脂15g， 水 1.0L。
[0024] 樣品處理；在每支含±壤樣本的無菌試管中加入10血含抗生素的樣品處理液，并 于高速混勻機(jī)中混勻，靜置30min。
[002引接種；分別將混合后的處理液取50化于2血的離屯、管中（第一管)，并加入950化 生理鹽水(無抗生素）即稀釋20倍，從第一管中取50uL于第二管并計(jì)入950yL生理鹽水， W上步驟重復(fù)，最后取稀釋倍數(shù)為400,8000,1600