Pcsk9蛋白的d374y突變體在抑制肝癌細(xì)胞遷移中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[000。 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種PCSK9蛋白的D374Y突變體在抑制肝癌細(xì)胞 遷移中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素 9(proproteinconvertasesubtilisin-l;Lke/ kexintype9，PCS腳）是繼LDLR、APOB后被定位的第S個ADH(autosomaldominant hypercholesterolemia)主效基因。該基因由Seid址etal.首次克隆得到，并定義為細(xì)胞 調(diào)亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化酶1 (apoptosis-regulatedconvertasel，Narc-l)，指出其在肝再生和神經(jīng) 元分化過程中的潛在作用。PCSK9蛋白主要表達(dá)于具有再生和分化能力的細(xì)胞中。PCSK9 在肝臟的細(xì)胞的功能主要表現(xiàn)為對（low-densitylipoproteinreceptor,LDLR)的翻譯 后調(diào)控作用；PCSK9分泌蛋白能與肝細(xì)胞膜上LDLR相結(jié)合，介導(dǎo)PCS腳-LDLR復(fù)合體的胞內(nèi) 溶酶體降解過程，而不影響LDLR的內(nèi)吞作用和載脂蛋白B(apolipoproteinB,apoB)的合 成，因此PCSK9的高表達(dá)或功能獲得性突變與動脈粥樣硬化疾病有直接的關(guān)系。近年來的 研究報道顯示，PCSK9參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，如影響肝臟損傷修復(fù)、膽固醇運輸、細(xì)胞 調(diào)亡等性狀。如果PCSK9基因缺失，肝臟再生能力將顯著下降。PCSK9能夠促進(jìn)小腸上皮 細(xì)胞對膽固醇的吸收能力。PCSK9對細(xì)胞調(diào)亡的調(diào)控具有組織特異性。在肝臟中，PCSK9 能夠下調(diào)TNF-a通路，抑制肝細(xì)胞的調(diào)亡；而在神經(jīng)細(xì)胞中通過作用于載脂蛋白E受體 2(apolipoproteinEreceptor2,ApoER2)，參與神經(jīng)調(diào)亡過程，但不完全依賴caspase 途徑；在內(nèi)皮細(xì)胞中，抑制PCSK9基因的表達(dá)可W降低OX-LDL誘導(dǎo)的HUVECs化uman umbilicalveinendothelialcells)細(xì)胞的調(diào)亡效應(yīng)；在巨瞻細(xì)胞中PCSK9的表達(dá)量與 巨瞻細(xì)胞炎癥反應(yīng)的敏感性正相關(guān)，oxLDL誘導(dǎo)THP-1來源的巨瞻細(xì)胞中PCSK9的表達(dá)，而 PCSK9的干擾抑制炎癥因子的表達(dá)，使化a卵a(bǔ)B-alpha的降解和NF-ka卵a(bǔ)B的核轉(zhuǎn)運受到抑 制。
[0003] 綜上所述，PCSK9對細(xì)胞功能具有重要的調(diào)節(jié)作用，特別參與肝臟細(xì)胞的多種生物 學(xué)過程。然而，目前的研究報道中未見PCSK9對肝癌細(xì)胞遷移影響的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個目的是提供一種PCSK9蛋白的D374Y突變體在抑制肝癌細(xì)胞遷移中 的應(yīng)用。
[0005] 所述PCSK9蛋白的D374Y突變體具體為序列表中序列1所示蛋白質(zhì)；所述應(yīng)用具 體為在如下任一中的應(yīng)用：
[0006] (al)制備抑制肝癌細(xì)胞遷移的產(chǎn)品；
[0007] (a2)抑制肝癌細(xì)胞遷移；
[000引 （a3)下調(diào)Erk蛋白的磯酸化水平。
[0009] 編碼序列表中序列1所示蛋白質(zhì)的基因（即所述PCSK9蛋白的D374Y突變體的編 碼基因）在如下任一中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0010] (al)制備抑制肝癌細(xì)胞遷移的產(chǎn)品；
[0011] (a2)抑制肝癌細(xì)胞遷移；
[001引 （a3)下調(diào)Erk蛋白的磯酸化水平。
[0013] 含有所述基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在如下任一中的應(yīng)用 也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0014] (al)制備抑制肝癌細(xì)胞遷移的產(chǎn)品；
[0015] (a2)抑制肝癌細(xì)胞遷移；
[001引 （a3)下調(diào)Erk蛋白的磯酸化水平。
[0017] 上述（a2)所示的應(yīng)用為非疾病診斷性應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種抑制肝癌細(xì)胞遷移的產(chǎn)品。
[0019] 本發(fā)明所提供的抑制肝癌細(xì)胞遷移和/或下調(diào)Erk蛋白的磯酸化水平的產(chǎn)品，其 活性成分可為如下中至少一種：
[0020] (a)序列表中序列1所示蛋白質(zhì)；
[0021] 化）編碼序列表中序列1所示蛋白質(zhì)的基因；
[0022] (C)含有所述基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
[0023] 所述產(chǎn)品可為試劑盒。
[0024] W上所述基因可為如下中任一種：
[00幼 （1)序列表中序列2所示的DNA分子；
[002引 似在嚴(yán)格條件下與（1)限定的DNA分子雜交且編碼序列表中序列1所示蛋白質(zhì) 的DNA分子；
[0027] 做與（1)或似限定的DNA序列具有90%W上同源性且編碼序列表中序列1所 示蛋白質(zhì)的DNA分子。
[002引上述嚴(yán)格條件可為用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0. 1 %SDS和 1XSSC，0. 1 %SDS各洗膜一次。
[0029] 所述表達(dá)盒由能夠啟動所述基因表達(dá)的啟動子，所述基因，W及轉(zhuǎn)錄終止序列組 成。
[0030] 在本發(fā)明中，所述重組載體為重組表達(dá)載體。所述重組表達(dá)載體具體為在慢病毒 載體LV6的多克隆位點處插入所述基因（序列2)后得到的重組質(zhì)粒。所述多克隆位點具 體為Notl和化il。
[0031] 所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系為非繁殖材料。
[0032] 在本發(fā)明中，所述肝癌細(xì)胞為人源肝癌細(xì)胞，具體為化pG2細(xì)胞。
[0033] 在本發(fā)明中，所述抑制肝癌細(xì)胞遷移是通過下調(diào)Erk蛋白的磯酸化水平來實現(xiàn) 的。所述Erk蛋白為序列表中序列5所示的蛋白質(zhì)巧rkl亞型）或序列表中序列6所示的 蛋白質(zhì)巧rk2亞型）。
[0034] 本發(fā)明還有一個目的在于提供一種降低肝癌細(xì)胞遷移速度的方法。
[00巧]本發(fā)明所提供的降低肝癌細(xì)胞遷移速度的方法，具體可包括如下步驟：向目的肝 癌細(xì)胞中導(dǎo)入編碼序列表中序列1所示蛋白質(zhì)的基因，得到表達(dá)所述基因的重組肝癌細(xì) 胞；所述重組肝癌細(xì)胞的遷移速度與所述目的肝癌細(xì)胞的遷移速度相比降低。
[0036] 所述方法為非疾病診斷性方法。
[0037] 所述基因可為如下中任一種：
[00測 （1)序列表中序列2所示的DNA分子；
[003引 似在嚴(yán)格條件下與（1)限定的DNA分子雜交且編碼序列表中序列1所示蛋白質(zhì) 的DNA分子；
[0040] 做與（1)或似限定的DNA序列具有90%W上同源性且編碼序列表中序列1所 示蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0041] 上述嚴(yán)格條件可為用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0. 1 %SDS和 1XSSC，0. 1 %SDS各洗膜一次。
[0042] 其中，所述基因是通過重組表達(dá)載體的形式導(dǎo)入所述目的肝癌細(xì)胞中的。所述重 組表達(dá)載體具體可為在慢病毒載體LV6的多克隆位點Notl和化il處插入所述基因（序列 2)后得到的重組質(zhì)粒。
[0043] 在本發(fā)明中，所述肝癌細(xì)胞為人源肝癌細(xì)胞，具體為化pG2細(xì)胞。
[0044] 本發(fā)明利用慢病毒包裝的過表達(dá)載體實現(xiàn)PCSK9蛋白的D374Y突變體在化pG2細(xì) 胞中的穩(wěn)定高表達(dá)，并對該細(xì)胞的增殖和遷移能力進(jìn)行了檢測。實驗證明，PCSK9蛋白的 D374Y突變體過表達(dá)對化pG2細(xì)胞的增殖能力無明顯的影響，但是顯著抑制細(xì)胞的遷移能 力；PCSK9蛋白的D374Y突變體對肝癌細(xì)胞的遷移能力的抑制是通過Erk信號通路的調(diào)控 起作用的。本發(fā)明對肝癌的治療具有重要意義。
【附圖說明】
[0045] 圖1為人PCSK9基因在化pG2細(xì)胞中的過表達(dá)檢測。A為慢病毒包裝的PCSK9過 表達(dá)載體在化pG2細(xì)胞中的翻譯水平檢測。B為化pG2細(xì)胞培養(yǎng)液中PCSK9濃度的化ISA 檢測。LV6-D374Y、LV6-PCSK9、LV6-NC分別表示連接PCS腳-D374Y突變體序列、PCSK9野生 型序列和NC空白穿梭質(zhì)粒。內(nèi)參為e-actin。****，？< 0. 0001。
[0046] 圖2為PCSK9過表達(dá)對化pG2增殖的影響。A為CCK80D450值與化pG2細(xì)胞數(shù)量相 關(guān)性的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。B為CCK8檢測HepG2生長曲線。C為E加細(xì)胞增殖檢測，E加巧光染 色圖，巧光信號顯示的是細(xì)胞核，其中藍(lán)色表示細(xì)胞處于有絲分裂間期，紅色表示細(xì)胞處于 有絲分裂期；細(xì)胞增殖統(tǒng)計結(jié)果如柱狀圖所示。D為有絲分裂標(biāo)志蛋白PCNA表達(dá)量的檢測， W化stone-2A作為細(xì)胞核的內(nèi)參，0 -actin作為細(xì)胞質(zhì)/總蛋白的內(nèi)參，"NC"為LV6-NC的 縮寫，"D"為LV6-D374Y的縮寫，"質(zhì)"表示細(xì)胞質(zhì)蛋白，"核"表示細(xì)胞核蛋白。LV6-D374Y、 LV6-NC分別表示連接PCS腳-D374Y突變體序列和NC空白穿梭質(zhì)粒。***，P< 0. 001。
[0047] 圖3為PCSK9過表達(dá)對化pG2遷移的影響。A為化pG2細(xì)胞劃痕修復(fù)檢測結(jié)果，分 別于劃痕后化，2化，4她，7化，9化，10她拍照。B、C分別化pG2細(xì)胞transwell檢測，C為 B的統(tǒng)計結(jié)果。D為化pG2小G蛋白活性檢測，分別檢測S種小G蛋白，cdc42、rhoa、rac-l 的活性。A-D中，"NC"為LV6-NC的縮寫，"D374Y"為LV6-D374Y的縮寫。E為Racl、化oA、 CDC42總蛋白檢測。F為化k、Akt蛋白磯酸化檢測，化pG2細(xì)胞饑餓處理化，2h，化，她，分別 檢測不同基因型細(xì)胞化以41^、1111'(?、1服蛋白的磯酸化與總蛋白水平。0為口〔5腳基因敲除 小鼠肝臟組織Erk蛋白磯酸化水平檢測。H為化k磯酸化特異性抑制劑U0126預(yù)處理化pG2 細(xì)胞。I為U0126預(yù)處理的化pG2細(xì)胞遷移水平的檢測。H和I中，control為未經(jīng)U0126 預(yù)處理的對照組。F-H中，蛋白前的P表示"磯酸化"，T表示"總"