提高林可霉素a組份和減少林可霉素b組份的重組工程菌及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種提高林可霉素A組份和減少林可霉素B 組份的重組工程菌及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 林可霉素是由林可鏈霉菌產(chǎn)生的的林可酷胺類(lèi)抗生素，主要用于治療革蘭氏陽(yáng)性 菌引起的感染性疾病。林可鏈霉菌發(fā)酵過(guò)程中，產(chǎn)生林可霉素A和B兩種組份。林可霉素 A組份是藥效活性組份，林可霉素B組份是副產(chǎn)物，其活性只有A組份的25%，且毒性較大。 發(fā)酵中產(chǎn)生的過(guò)量林可霉素B需要在下游分離純化工藝中除去，才能滿足藥品的要求。因 此提高林可霉素A組份，減少林可霉素B組份，對(duì)林可霉素發(fā)酵工業(yè)過(guò)程是非常重要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是針對(duì)目前林可霉素生產(chǎn)現(xiàn)狀，提供提高林可霉素A組份和減少林 可霉素B組份的重組工程菌。
[0004] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述提高林可霉素A組份和減少林可霉素B組份的重 組工程菌在發(fā)酵提高林可霉素A組份和減少B組份的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的第=個(gè)目的是提供第二種提高林可霉素A組份和減少林可霉素B組份的 重組工程菌。
[0006] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供第二種提高林可霉素A組份和減少林可霉素B組份的 重組工程菌在發(fā)酵提高林可霉素A組份和減少B組份的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供第=種提高林可霉素A組份和減少林可霉素B組份的 重組工程菌。
[000引本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供第=種提高林可霉素A組份和減少林可霉素B組份的 重組工程菌在發(fā)酵提高林可霉素A組份和減少B組份的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的第走個(gè)目的是提供第四種提高林可霉素A組份和減少林可霉素B組份的 重組工程菌。
[0010] 本發(fā)明的第八個(gè)目的是提供第四種提高林可霉素A組份和減少林可霉素B組份的 重組工程菌在發(fā)酵提高林可霉素A組份和減少B組份的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0012] 一種提高林可霉素A組份和減少林可霉素B組份的重組工程菌，用下述方法構(gòu) 建：
[001引 （1)W林可鏈霉菌基因組為模板，WSEQIDNo. 1所示序列為上游引物，WSEQID No. 2所不序列為下游引物，克隆ImbW基因；
[0014] (2)將ImbW基因W酶切連接的方式，連接到pUWL201apr載體上，構(gòu)建PAP04載體；
[0015](3)將PAP04載體轉(zhuǎn)化到林可鏈霉菌，篩選，獲得提高林可霉素A組份和減少林可 霉素B組份的重組工程菌。
[0016] 上述一種重組工程菌在發(fā)酵提高林可霉素A組份和減少B組份的應(yīng)用。
[0017] 第二種提高林可霉素A組份和減少林可霉素B組份的重組工程菌，用下述方法構(gòu) 建：
[0018] (1)W林可鏈霉菌基因組為模板，WSEQIDNo.3所示序列為上游引物，WSEQID No. 4所不序列為下游引物，克隆metK基因；
[0019] (2)將metK基因W酶切連接的方式，連接到pUWL201apr載體上，構(gòu)建PAP05載體；
[0020] (3)將PAP05載體轉(zhuǎn)化到林可鏈霉菌，篩選，獲得提高林可霉素A組份和減少林可 霉素B組份的重組工程菌。
[0021] 上述第二種重組工程菌在發(fā)酵提高林可霉素A組份和減少B組份的應(yīng)用。
[0022] 第=種提高林可霉素A組份和減少林可霉素B組份的重組工程菌，用下述方法構(gòu) 建：
[002引（1)W林可鏈霉菌基因組為模板，WSEQIDNo. 1所示序列為上游引物，WSEQID No. 2所不序列為下游引物，克隆ImbW基因；
[0024] (2)將ImbW基因W酶切連接的方式，連接到pUWL201apr載體上，構(gòu)建PAP04載體；
[0025] (3)W PAP04載體為模板，WSEQIDNo. 5所示序列為上游引物，WSEQIDNo. 2 所示序列為下游引物，克隆ImbW基因；
[0026] (4)W林可鏈霉菌基因組為模板，WSEQIDNo. 3所示序列為上游引物，WSEQID No. 4所示序列為下游引物，克隆metK基因；
[0027] (5)將metK基因W酶切連接的方式，連接到pUWL201apr載體上，構(gòu)建PAP05載體； 將步驟（3)獲得的ImbW基因W酶切連接的方式，連接到PAP05載體上，構(gòu)建PAP06載體； [002引 （6)將PAP06載體轉(zhuǎn)化到林可鏈霉菌，篩選，獲得提高林可霉素A組份和減少B組 份的重組工程菌。
[0029] 上述第=種重組工程菌在發(fā)酵提高林可霉素A組份和減少B組份的應(yīng)用。
[0030] 第四種提高林可霉素A組份和減少林可霉素B組份的重組工程菌，用下述方法構(gòu) 建：
[0031] (1)W林可鏈霉菌基因組為模板，WSEQIDNo. 1所示序列為上游引物，WSEQID No. 2所不序列為下游引物，克隆ImbW基因；
[003引（2)將ImbW基因W酶切連接的方式，連接到pUWL201apr載體上，構(gòu)建PAP04載體；
[0033] (3)W PAP04載體為模板，WSEQIDNo. 5所示序列為上游引物，WSEQIDNo. 2 所示序列為下游引物，克隆ImbW基因；
[0034] (4)W林可鏈霉菌基因組為模板，WSEQIDNo. 3所示序列為上游引物，WSEQID No. 4所示序列為下游引物，克隆metK基因；
[0035] (5)將metK基因W酶切連接的方式，連接到pUWL201apr載體上，構(gòu)建PAP05載體； 將步驟（3)獲得的ImbW基因W酶切連接的方式，連接到PAP05載體上，構(gòu)建PAP06載體；
[0036] (6)W林可鏈霉菌基因組為模板，W SEQIDNo. 6所示序列為上游引物，W SEQID 齡.7所示序列為下游引物，克隆1111村基因；^569 10齡.8所示序列為上游引物，^569 IDNo. 9所不序列為下游引物，克隆ImbG基因；
[0037] (7)WlmbJ基因和ImbG基因?yàn)槟０?，WSEQIDNo. 6 為上游引物，WSEQIDNo. 9 為下游引物，進(jìn)行重疊延伸PCR，獲得ImbJ-lmbG串聯(lián)片段；
[003引 （8)將ImbJ-lmbG串聯(lián)片段連接到PAP06載體上，構(gòu)建了PAP07載體；
[0039] (9)將PAP07載體轉(zhuǎn)化到林可鏈霉菌，篩選，獲得提高林可霉素A組份和減少林可 霉素B組份的重組工程菌。
[0040] 上述第四種重組工程菌在發(fā)酵提高林可霉素A組份和減少B組份的應(yīng)用。
[0041] 本發(fā)明重組菌不僅使林可霉素A組份發(fā)酵效價(jià)高，而且林可霉素B組份下降。有 利于簡(jiǎn)化下游分離純化過(guò)程，降低生產(chǎn)成本、節(jié)能、減排，提高經(jīng)濟(jì)效益。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 本發(fā)明各實(shí)施例所使用的林可鏈霉菌來(lái)源于ATCC25466,感受態(tài)大腸桿菌為感受 態(tài)畑5a。
[0043] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0044] 實(shí)施例1
[0045] 一種提高林可霉素A組份和減少B組份的重組工程菌，用下述方法構(gòu)建：
[0046] (1)W林可鏈霉菌基因組為模板，設(shè)計(jì)如下引物；WSEQIDNo.1所示序列為上游 引物，WSEQIDNo.2所示序列為下游引物，克隆ImbW基因佑enBank:抓124663. 1);
[0047] 5>-GCCCAAGCTTCTTCAGACGGACCGAGGTGCC-3'(下劃線處為Hindlll酶切位點(diǎn)）；SEQ IDNo.1
[0048] 5' -GCCGGGATCCTCCGCGTGGTTCAGGGCACA-3 '（下劃線處為BamHI酶切位點(diǎn)）；SEQ IDNo.2
[0049] 50yLPCR反應(yīng)體系為；lOuL的5Xbuffer，5yLdNTPs，5uLDMS0，1uL上游引 物，1yL下游引物，1yL基因組模板，1yL聚合酶，余量用純凈水補(bǔ)齊。
[0化0] PCR參數(shù)如下；95°C5min;95°C30s，6(TC30s，72°Clmin，30 個(gè)循環(huán)；72°ClOmin; 4°C+
[CK)5U 擴(kuò)增得到ImbW基因片段。用DM純化試劑盒，回收PCR片段。
[005引似將ImbW基因W酶切連接的方式，連接到pUWL201apr載體值U，L.，Liu, R-H.,Ying,L.,Zhao,G-R. (2012)An efficient intergeneric conjugation of DNA from Escherichia coli to mycelia of the lincomycin-producer Streptomyces lincolnensis.IntJMol Scil3, 4797-4806.)上，構(gòu)建了pAP04載體；
[005引 50yL酶切體系為；5yL10Xbuffer，30yL質(zhì)粒或基因片段，5uL限制性?xún)?nèi)切 酶，余量用純凈水補(bǔ)齊。37°C反應(yīng)30min。反應(yīng)結(jié)束后，用DNA純化試劑盒，回收酶切產(chǎn)物。 [0化4] 用T4連接酶對(duì)基因片段和載體片段進(jìn)行連接，22°C反應(yīng)30min。
[0化5] 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，在LB固體培養(yǎng)基，加入安普霉素抗生素，混勻，鋪 平板。37°C培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)夜，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。將構(gòu)建好的載體用測(cè)序，確保序列的正確性。[0化6] (3)將PAP04載體轉(zhuǎn)化到林可鏈霉菌，篩選，獲得提高林可霉素A組份和減少林可 霉素B組份的重組工程菌。
[0化7] 篩選步驟為；按照鏈霉菌遺傳轉(zhuǎn)化的常規(guī)方法，包括原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化或大腸桿 菌-鏈霉菌結(jié)合轉(zhuǎn)移方法，將PAP04載體轉(zhuǎn)化到林可鏈霉菌中。用安普霉素抗生素，篩選獲 得重組菌株。繁殖抱子，用20%甘油，在-80°C保存。
[0化引 實(shí)施例2
[0化9] 第二種提高林可霉素A組份和減少林可霉素B組份的重組工程菌，用下述方法構(gòu) 建：
[0060] (1)W林可鏈霉菌基因組為模板，設(shè)計(jì)如下引物；WSEQIDNo. 3所示序列為上游 引物，WSEQIDNo. 4所示序列為下游引物，克隆metK基因佑enBank;KP225159);
[006U 5> -ACGCAAGCTTGTGTCCCGTCGTCTGTTCAC-3'(下劃線處為Hindlll酶切位點(diǎn)）；SEQ IDNo.3
[0062] 5' -GCCGGAATTCGGGGCACCGCGTAGTCGAAGTA-3'(下劃線處為EcoRI酶切位點(diǎn)）；SEQ IDNo.4
[0063] PCR反應(yīng)體系和參數(shù)設(shè)置同實(shí)施例1(其中引物不同）。
[0064] 擴(kuò)增得到metK基因片段。用DNA純化試劑盒，回收PC