一種n-乙酰氨基葡萄糖的發(fā)酵生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種N-乙酰氨基葡萄糖的發(fā)酵生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]氨基葡萄糖的用途十分廣泛，主要應(yīng)用于食品、醫(yī)療、化妝品、農(nóng)牧業(yè)等領(lǐng)域。目前，氨基葡萄糖最多的被用于關(guān)節(jié)炎的預(yù)防和治療。氨基葡萄糖是結(jié)締組織與軟骨細(xì)胞的主要成分，如果關(guān)節(jié)發(fā)生病變，補(bǔ)充氨基葡萄糖可以修補(bǔ)受損的軟骨，增加關(guān)節(jié)間的潤滑。
[0003]現(xiàn)在，我國的氨基葡萄糖大多以殼聚糖為原料生產(chǎn)，但是存在原料來源不穩(wěn)定，一些人群存在過敏反應(yīng)等缺點(diǎn)。雖然微生物發(fā)酵法生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖(在含有N-乙酰氨基葡萄糖的發(fā)酵液中，加入0.lmol/L的鹽酸，100°C下反應(yīng)3h，可以把90%以上的N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)化為氨基葡萄糖)可以克服以上缺點(diǎn)，但微生物發(fā)酵生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖存在產(chǎn)量低、轉(zhuǎn)化率低和副產(chǎn)物乙酸、谷氨酸含量高的現(xiàn)象，因此，需要開發(fā)一種N-乙酰氨基葡萄糖的發(fā)酵新工藝，以提高N-乙酰氨基葡萄糖的發(fā)酵產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率，同時(shí)降低發(fā)酵副產(chǎn)物乙酸、谷氨酸的含量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種N-乙酰氨基葡萄糖的發(fā)酵生產(chǎn)方法。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0006]一種N-乙酰氨基葡萄糖的發(fā)酵生產(chǎn)方法，在發(fā)酵過程中，當(dāng)發(fā)酵液的殘?zhí)呛拷抵?.5g/L以下時(shí)，按照5?8g/L.h的流加速率向發(fā)酵液中流加葡萄糖溶液，當(dāng)發(fā)酵液的0D660nm = 28?31時(shí)，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，再按照0.5?0.8g/L *h的流加速率向發(fā)酵液中流加尿素溶液。流加尿素時(shí)，葡萄糖仍同時(shí)流加。
[0007]進(jìn)一步地，所述尿素溶液的流加速率與葡萄糖溶液的流加速率之比為1:10。
[0008]進(jìn)一步地，所述IPTG的加入量為0.03mM。
[0009]進(jìn)一步地，所述葡萄糖溶液的質(zhì)量濃度為55%。
[0010]進(jìn)一步地，所述尿素溶液的質(zhì)量濃度為15%。
[0011]進(jìn)一步地，所述方法包括以下步驟:
[0012](I)種子培養(yǎng):
[0013]配制種子培養(yǎng)基，用濃度為25% (m/m)的氨水調(diào)種子培養(yǎng)基pH至7.3，向種子培養(yǎng)基中通飽和蒸汽至121°C，保溫30min，設(shè)定種子培養(yǎng)條件:溫度37°C，罐壓0.05mpa，通風(fēng)比1:0.5，轉(zhuǎn)速300rpm，pH6.8?7.0 ;接入產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)種子0D660nm = 3.5?5范圍區(qū)間時(shí)，作為種子成熟標(biāo)準(zhǔn)；
[0014](2)發(fā)酵培養(yǎng):
[0015]配制發(fā)酵培養(yǎng)基，121°C，滅菌30min，降溫后設(shè)定發(fā)酵培養(yǎng)條件:溫度37°C，罐壓0.03?0.05mpa，通風(fēng)比1: 0.5?1: 1，轉(zhuǎn)速300?500rpm，pH全程用25% (m/m)氛水自控為6.9?7.0 ;將成熟的N-乙酰氨基葡萄糖種子液按照10% (V/V)接種量接種到發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵過程中通過調(diào)節(jié)罐壓、風(fēng)量、轉(zhuǎn)速控制溶氧30-40% ;
[0016]當(dāng)發(fā)酵液的殘?zhí)呛拷抵?.5g/L以下時(shí)，按照5?8g/L-h的流加速率向發(fā)酵液中流加葡萄糖溶液，當(dāng)發(fā)酵液的0D660nm = 28?31時(shí)，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，再按照0.5?0.8g/L.h的流加速率向發(fā)酵液中流加尿素溶液；培養(yǎng)52?56小時(shí)。
[0017]進(jìn)一步地，所述種子培養(yǎng)基為:葡萄糖15g/L (單消)，磷酸氫二鉀I lg/L，磷酸二氫鉀16g/L，酵母浸粉lg/L，蘇氨酸0.2g/L，蛋氨酸0.15g/L，硫酸鎂0.5g/L，硫酸錢5g/L，硫酸錳 0.013mg/L,硫酸鐵 0.024mg/L,硫酸鋅 0.047mg/L,氯化鈷 0.01mg/L。
[0018]進(jìn)一步地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為:葡萄糖5g/L(單消)，磷酸氫二鉀16g/L，磷酸二氫鉀10g/L，酵母浸粉0.3g/L，酵母膏0.lg/L,蘇氨酸0.lg/L,蛋氨酸0.15g/L，硫酸鎂0.25g/L，硫酸錢3g/L，氯化鉀0.lg/L，硫酸猛0.015mg/L，硫酸鐵0.35mg/L，硫酸鋅0.41mg/L，氯化鈷 0.02mg/L。
[0019]作為優(yōu)選，流加尿素溶液后，培養(yǎng)54小時(shí)。
[0020]本發(fā)明的有益效果在于:
[0021]本發(fā)明提供的N-乙酰氨基葡萄糖的發(fā)酵生產(chǎn)方法，在發(fā)酵過程通過IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，并優(yōu)化了誘導(dǎo)時(shí)葡萄糖溶液和尿素溶液的流加速率，顯著提高發(fā)酵終點(diǎn)N-乙酰氨基葡萄糖含量和轉(zhuǎn)化率。
【具體實(shí)施方式】
[0022]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0023]在下述實(shí)施例和對(duì)比例中:
[0024]OD值測定:采用7230G可見分光光度計(jì)，在波長660nm可見光下測定吸光值。
[0025]按照GB/T5009.7-2008的方法測定還原糖的濃度。
[0026]N-乙酰氨基葡萄糖含量測定:高效液相色譜法。
[0027]乙酸含量測定:高效液相色譜法。
[0028]谷氨酸含量測定:取發(fā)酵液離心后的上清液，稀釋到殘谷氨酸濃度在lg/L以內(nèi)，用生物傳感分析儀測定。
[0029]轉(zhuǎn)化率(％ ) =N-乙酰氨基葡萄糖量/總耗糖量X 100%。
[0030]實(shí)施例1
[0031](I)配制種子培養(yǎng)基:葡萄糖15g/L，磷酸氫二鉀llg/L，磷酸二氫鉀16g/L，酵母浸粉lg/L，蘇氨酸0.2g/L,蛋氨酸0.15g/L，硫酸鎂0.5g/L，硫酸銨5g/L，硫酸錳0.013mg/L，硫酸鐵 0.024mg/L，硫酸鋅 0.047mg/L，氯化鈷 0.01mg/L。
[0032]投入到50L發(fā)酵罐中，用濃度為25% (m/m)的氨水調(diào)種子培養(yǎng)基pH至7.3，向種子培養(yǎng)基中通飽和蒸汽至121°C，保溫30min，設(shè)定種子培養(yǎng)條件:溫度37°C，罐壓0.05mpa,通風(fēng)比1:0.5，轉(zhuǎn)速300rpm，pH6.8-7.0。接入產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)種子0D660nm = 3.5-5范圍區(qū)間時(shí)，作為種子成熟標(biāo)準(zhǔn)。
[0033](2)配制發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖5g/L(單消)，磷酸氫二鉀16g/L，磷酸二氫鉀1g/L，酵母浸粉0.3g/L，酵母膏0.lg/L,蘇氨酸0.lg/L,蛋氨酸0.15g/L，硫酸鎂0.25g/L，硫酸錢3g/L，氯化鉀0.lg/L,硫酸猛0.015mg/L,硫酸鐵0.35mg/L，硫酸鋅0.41mg/L，氯化鈷0.02mg/Lo
[0034]投入到50L發(fā)酵罐中，121°C，滅菌30min，降溫后設(shè)定發(fā)酵培養(yǎng)條件:溫度37°C，罐壓 0.03-0.05mpa，通風(fēng)比 1: 0.5-1:1，轉(zhuǎn)速 300_500rpm，pH 全程用 25 % (m/m)自控為 7.0。將成熟的N-乙酰氨基葡萄糖種子液按照10% (V/V)接種量接種到發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵過程中通過調(diào)節(jié)罐壓、風(fēng)量、轉(zhuǎn)速控制溶氧30-40%。
[0035]當(dāng)N-乙酰氨基葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)過程中殘?zhí)墙抵?.5g/L以下時(shí)，按照5g/L.h的流加速率向N-乙酰氨基葡萄糖發(fā)酵液中流加55% (m/m)葡萄糖溶液。
[0036]當(dāng)N-乙酰氨基葡萄糖發(fā)酵液0D660nm = 28-31區(qū)間時(shí)，一次性加入0.03mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，此時(shí)按照葡萄糖溶液與尿素溶液質(zhì)量比10:1的速率流加尿素溶液，即按照流加速率0.5g/L.h向N-乙酰氨基葡萄糖發(fā)酵液中流加15% (m/m)尿素溶液。
[0037]本發(fā)明根據(jù)發(fā)酵后期不產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖或者產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖較慢來判斷發(fā)酵終點(diǎn)，發(fā)酵培養(yǎng)周期54小時(shí)，N-乙酰氨基葡萄糖含量為107g/L，轉(zhuǎn)化率為38.3%,乙酸含量為3.9g/L，谷氨酸含量為5.7g/L。
[0038]實(shí)施例2
[0039]當(dāng)N-乙酰氨基葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)過程中殘?zhí)墙抵?.5g/L以下時(shí)，按照6g/L.h的流加速率向N-乙酰氨基葡萄糖發(fā)酵液中流加55% (m/m)葡萄糖溶液。此時(shí)按照葡萄糖溶液與尿素溶液質(zhì)量比10:1的速率流加尿素溶液，即按照流加速率0.6g/L.h向N-乙酰氨基葡萄糖發(fā)酵液中流加15% (m/m)尿素溶液。其他條件與培養(yǎng)方法同實(shí)施例1。發(fā)酵培養(yǎng)54h時(shí)，N-乙酰氨基葡萄糖含量為110g/L，轉(zhuǎn)化率為40.1%，乙酸含量為1.9g/L，谷氨酸含量為 2.lg/L ο
[0040]實(shí)施例3
[0041]當(dāng)N-乙酰氨基葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)過程中殘?zhí)墙抵?.5g/L以下時(shí)，按照7g/L.h的流加速率向N-乙酰氨基葡萄糖發(fā)酵液中流加55% (m/m)葡萄糖溶液。此時(shí)按照葡萄糖溶液與尿素溶液質(zhì)量比10:1的速率流加尿素溶液，即按照流加速率0.7g/L.h向N-乙酰氨基葡萄糖發(fā)酵液中流加15% (m/m)尿素溶液。其他條件與培養(yǎng)方法同實(shí)施例1。發(fā)酵培養(yǎng)54h時(shí)，N-乙酰氨基葡萄糖含量為98g/L，轉(zhuǎn)化率為38.5%，乙酸含量為3.2g/L，谷氨酸含量為 3.5g/Lo
[0042]實(shí)施例4
[0043]當(dāng)N-乙酰氨基葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)過程中殘?zhí)墙抵?.5g/L以下時(shí)，按照8g/L.h的流加速率向N-乙酰氨基葡萄糖發(fā)酵液中流加55% (m/m)葡萄糖溶液。此時(shí)按照葡萄糖溶液與尿素溶液質(zhì)量比10:1的速率流加尿素溶液，即按照流加速率0.8g/L.h向N-乙酰氨基葡萄糖發(fā)酵液中流加15% (m/m)尿素溶液。其他條件與培養(yǎng)方法同實(shí)施例1。發(fā)酵培養(yǎng)54h時(shí)，N