一種纖維材料的細(xì)胞毒性檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于纖維類醫(yī)療器械材料及制品的安全性技術(shù)評(píng)價(jià)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種纖 維材料的細(xì)胞毒性檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 醫(yī)用纖維特別是可降解醫(yī)用纖維的研究和應(yīng)用已成為植入醫(yī)療器械研發(fā)的熱點(diǎn)， 對(duì)其細(xì)胞毒性的評(píng)價(jià)是臨床前研究的重要內(nèi)容。生物醫(yī)用材料及相關(guān)醫(yī)療器械的細(xì)胞毒性 測(cè)試和評(píng)價(jià)方法主要有ISO10993. 5-2009(醫(yī)療器械的生物學(xué)評(píng)價(jià)第5部分；體外細(xì)胞毒 性試）和中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T16886. 5-2003,該方法適用于醫(yī)療器械的體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。 上述兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)基本上等同，主要用于醫(yī)療器械的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)。
[0003] 由于醫(yī)療器械設(shè)及的范圍太廣、材料種類繁多，現(xiàn)有測(cè)試方法中的規(guī)定比較籠統(tǒng)， 在實(shí)際應(yīng)用中的可操作性不理想。上述標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用于醫(yī)用纖維的細(xì)胞毒性測(cè)試時(shí)，在樣品制 備、細(xì)胞毒性的定量測(cè)試方面就存在不足。
[0004] 標(biāo)準(zhǔn)中的浸提法在樣品制備方法上存在不足，對(duì)于醫(yī)用纖維長絲來說，由于其長 徑比大、表面積不是平面，纖維直徑不同，比表面積差異很大；如果按照不規(guī)則形狀固體器 械執(zhí)行，如0. 2g/血的浸提比例，那么溶液無法完全浸泡纖維。
[0005] 勻漿法在樣品制備方法上也存在不足，原因在于；在冰浴上，用勻漿儀將材料制備 成不同濃度的混懸液，對(duì)材料進(jìn)行細(xì)胞毒性，采用該方法制樣時(shí)，由于制備醫(yī)用纖維的材料 來源廣泛，包括合成材料(聚哲基己酸醋、聚乳酸、聚己內(nèi)醋等）和天然材料(海藻酸鋼纖維、 殼聚糖纖維）制備的纖維，W及非降解性纖維(主要指聚己締纖維、巧龍纖維等)，各種材料 由于強(qiáng)度和初性差異較大，導(dǎo)致材料的力學(xué)性能差異很大。在制漿過程中，初性好的材料不 容易破碎，而初性差的材料容易破碎。
[0006] 直接接觸法適用于存在一定的平面和規(guī)則幾何外形的樣品，纖維材料在實(shí)驗(yàn)過程 中操作難度較大；在我們前期的研究中發(fā)現(xiàn)，纖維材料采用直接接觸法進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 時(shí)，最簡便的方法是將長絲纏結(jié)成團(tuán)塞入孔板。然而，纏團(tuán)的長絲在實(shí)驗(yàn)過程中容易散開， 松緊程度不好控制，測(cè)試結(jié)果不理想。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種纖維材料的細(xì)胞毒性檢測(cè) 方法。
[0008] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是； 一種纖維材料的細(xì)胞毒性檢測(cè)方法，其特征在于；將統(tǒng)一長度的纖維整齊排列制成片 狀單體，所得片狀單體采用浸提法或直接接觸法，進(jìn)行MTT細(xì)胞毒性檢測(cè)。
[0009] 優(yōu)選的，采用超聲波焊接將統(tǒng)一長度的纖維整齊排列制成片狀單體。
[0010] 優(yōu)選的，將統(tǒng)一長度的纖維整齊排列制成片狀單體的方法，包括W下步驟： 1)裁取統(tǒng)一長度的纖維，將纖維在聚四氣己締薄膜上整齊排列成近似平行狀態(tài)； 2) 在排列整齊的纖維上面覆蓋一層聚四氣己締薄膜，放入超聲波焊接機(jī)中； 3) 采用點(diǎn)柱型或網(wǎng)格型的焊接模具進(jìn)行焊接，得片狀單體。
[0011] 優(yōu)選的，所述檢測(cè)方法，包括W下步驟： 將統(tǒng)一長度的纖維整齊排列制成片狀單體，將所得片狀單體浸提后得到的浸提液或片 狀單體本身，加入到采用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞中，解育，解育結(jié)束后，MIT染色檢測(cè)細(xì) 胞存活率。
[0012] 優(yōu)選的，所述細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期。
[0013] 優(yōu)選的，所得片狀單體在無血清的細(xì)胞培養(yǎng)液中浸提。優(yōu)選的，浸提條件；無菌條 件下，于37 + 1 °C，浸提24 + 2h。
[0014] 優(yōu)選的，所述片狀單體直接加入到采用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞前，先在常規(guī) 細(xì)胞培養(yǎng)液浸透。優(yōu)選的，浸透時(shí)間為15~30min。對(duì)于容易吸水的片狀單體，為防止樣 品對(duì)常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)液的吸附，采取提前在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)液中浸透。
[0015] 優(yōu)選的，所述纖維為纖維長絲。優(yōu)選的，所述纖維為醫(yī)用纖維長絲。
[0016] 優(yōu)選的，纖維包括聚乳酸纖維、聚己內(nèi)醋纖維、聚哲基己酸醋纖維、聚酷胺纖維、上 述纖維的原材料任意復(fù)合所得纖維。
[0017] 本發(fā)明采用直接接觸法進(jìn)行MTT細(xì)胞毒性檢測(cè)時(shí)，將片狀單體采用紫外光滅菌， 在超凈工作臺(tái)內(nèi)用無菌剪刀裁剪，使樣品的覆蓋面積應(yīng)大于MTT細(xì)胞毒性檢測(cè)所用孔板面 積的四分之一、小于四分之S。
[0018] 本發(fā)明采用浸提法進(jìn)行MTT細(xì)胞毒性檢測(cè)時(shí)，可W測(cè)定樣品中的加工助劑、加工 過程中產(chǎn)生的低分子組分和殘留溶劑的毒理學(xué)危害，浸提條件模擬或嚴(yán)于臨床使用條件， 但不應(yīng)導(dǎo)致試驗(yàn)材料發(fā)生諸如烙化、溶解或化學(xué)結(jié)構(gòu)改變等明顯變化。
[0019] 將經(jīng)滅菌處理的片狀單體按表1的纖維直徑選擇浸提比例。
[0020] 表1纖維直徑與浸提液比例選擇_
本發(fā)明將纖維制備成片狀樣品，再進(jìn)行MTT細(xì)胞毒性檢測(cè)，具有操作簡單、重現(xiàn)性好和 判定方便等特點(diǎn)，解決了長絲狀纖維由于長徑比大、比表面積高而不能很好的進(jìn)行纖維類 醫(yī)療器械材料及制品的安全性技術(shù)評(píng)價(jià)的問題。
[0021] 本發(fā)明針對(duì)長徑比大、比表面積高的醫(yī)用纖維材料，通過改進(jìn)制樣方法和細(xì)胞毒 性測(cè)試指標(biāo)，建立了一種快速、重現(xiàn)性好的MIT檢測(cè)法。
[0022] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明采用超聲波焊接將纖維焊接制備成片狀樣品，具有制樣過程無污染和樣品狀態(tài) 基本保持不變的優(yōu)點(diǎn)，細(xì)胞毒性測(cè)試采用MTT細(xì)胞毒性檢測(cè)，也就是MIT染色后測(cè)定光密 度，具有操作簡單、重現(xiàn)性好和判定方便等特點(diǎn)，克服了現(xiàn)有技術(shù)無法解決長絲狀樣品制備 和直接接觸法測(cè)試差異較大的不足。
【具體實(shí)施方式】
[0023] -種纖維材料的細(xì)胞毒性檢測(cè)方法，包括W下步驟： 1) 取長度為10cm左右的聚乳酸（PLA)纖維長絲20~30g，將其在聚四氣己締薄膜上均勻 排列成近似平行狀態(tài)，上面再覆蓋一層聚四氣己締薄膜，將所得材料放入超聲波焊接機(jī)中， 采用點(diǎn)柱型或網(wǎng)格型的焊接模具進(jìn)行焊接，壓力1.OMPa、焊接時(shí)間1. 5s、冷卻時(shí)間2.Os，制 得薄片狀的醫(yī)用纖維膜； 2) 將醫(yī)用纖維膜采用紫外光滅菌，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用無菌剪刀剪成3mmX3mm的矩 形樣品，樣品的覆蓋面積應(yīng)大于孔板面積的四分之一、小于四分之S為宜，對(duì)于容易吸水的 樣品，為防止樣品對(duì)培養(yǎng)液的吸附，在37±rC下浸透15-30min;或者將經(jīng)滅菌處理的醫(yī) 用纖維膜按表1的纖維直徑選擇浸提比例： 醫(yī)用纖維膜采用無血清的培養(yǎng)液，DMEM;浸提條件；無菌條件下，于37 + 1 °C，浸泡 24 + 2h，去除醫(yī)用纖維膜，得浸提液； 3) 通過酶消化法（0. 25%的膜蛋白酶）將L929細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中轉(zhuǎn)移出來，離屯、細(xì)胞懸 液（200g，3min),然后將細(xì)胞重懸于培養(yǎng)液中調(diào)整細(xì)胞濃度為5X104個(gè)/111以接種密度 為5, 000個(gè)/孔（100y1培養(yǎng)液），于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)板，使細(xì)胞均勻地 分散在器皿的表面。（最外一圈的孔只加培養(yǎng)液，不作為測(cè)定孔用)，每個(gè)樣品組做5個(gè)平行 孔，其中左側(cè)和右側(cè)均放置空白對(duì)照孔(不加任何樣品的細(xì)胞培養(yǎng)液)，W判斷細(xì)胞接種的 誤差。在37±rC、5%C〇2條件下培養(yǎng)至半?yún)R合單細(xì)胞層，通過在相處顯微鏡下觀察，確認(rèn) 細(xì)胞接種誤差，及細(xì)胞的生長狀態(tài)； 4) 將培養(yǎng)液去除，加入各組樣品，所述樣品為3mmX3mm的矩形樣品或浸提液100 y以其中直接接觸樣品(矩形樣品）組需更換100yL培養(yǎng)基后，輕輕地將樣品放置在細(xì)胞 層表面，確保樣品至少覆蓋細(xì)胞層全部表面的四分之一。加樣完畢后，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)96孔培養(yǎng) 板，使樣品均勻分布在細(xì)胞層表面。解育4她后，至細(xì)胞為近匯合； 5) 將直接接觸樣品用無菌綴子取出(浸提液樣品不需處理)。在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞 的生長狀態(tài)。加入10化的CellCountingKit-8試劑（Dojindo公司，注意不要在孔中生 成氣泡)，輕輕敲擊培養(yǎng)板W混勻，繼續(xù)解育2h。在酶標(biāo)儀下分別測(cè)定5個(gè)孔的450nm處的 光密度值，并計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率。
[0024] 下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于