檢測金黃色葡萄球菌及blaz用的引物、試劑盒及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)計一種基于HRM技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌及耐甲氧新林耐藥基因blaz 用的引物；本發(fā)明還設(shè)及一種包括上述引物的雙重巧光PC檢測試劑盒，本發(fā)明還設(shè)及一種 采用上述試劑盒檢測金黃色葡萄球菌及耐甲氧新林耐藥基因blaz的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 葡萄球菌是革蘭氏陽性球菌中的一種，廣泛分布于自然界，如空氣、水、飼料 和一些食品中，也存在于人和動物的體表、鼻咽部及腸道。致病性葡萄球菌常引起各種 化脈性疾患、敗血癥或脈毒敗血癥，當(dāng)污染食品時，可引起食物中毒。1974年葡萄球菌 屬分為=種：金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌腳。其中金黃色葡萄球菌 staphylococ州S.aureus致病力最強，也最重要。金黃色葡萄球菌除了常引起皮膚、組織及 器官的化脈性炎癥外，其產(chǎn)生的腸毒素可沾染食物而致食物中毒。
[0003] 由于抗生素的使用，細(xì)菌也為了自身發(fā)展而不斷變異，就形成了細(xì)菌對抗菌藥物 的耐藥性，使本來有效的抗菌藥物在遇到耐藥菌引起的感染時療效下降甚至完全無效。金 黃色葡萄球菌至今仍然是國內(nèi)外醫(yī)院獲得性感染最常見的細(xì)菌之一。隨著0-內(nèi)獻(xiàn)胺類抗 生素在臨床的廣泛應(yīng)用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA在臨床分離的葡萄球菌中比例 不斷增加，MRSA幾乎對所有0-內(nèi)獻(xiàn)胺類抗生素都耐藥。1996年，又出現(xiàn)了首例對萬古霉 素敏感性下降的MRSA。一旦對萬古霉素耐藥，臨床可選用藥物將非常有限，從而造成治療上 的困難。研究可靠的檢測方法，對其準(zhǔn)確、及時的檢出，對于控制耐藥菌的播散極為重要。
[0004] 本發(fā)明選擇的目的基因為谷氨酸鐵還原合成酶glutamatesynthase-ferredoxin largesubunit,gltB，序列同源性相對保守，能夠較好的將金黃色葡萄球菌和其他食源性 致病菌進(jìn)行區(qū)分。也是1870-2007《食品中致病菌檢測方法實時PCR法》中檢測金黃色葡 萄球菌的祀基因。
[0005] 本發(fā)明選擇的另外一個目的基因為blaz基因，該基因負(fù)責(zé)編碼青霉素結(jié)合蛋 白2a(PBP2a)，它降低0-內(nèi)酷胺抗生素親和力，而PBP2a與固有的PBP2共同作用，使得 細(xì)菌盡管在0-內(nèi)酷胺抗生素的環(huán)境中也能合成細(xì)胞壁，使細(xì)菌對青霉素、頭抱菌素和碳 青霉締類抗生素耐藥。blaz基因位于葡萄球菌染色體mec盒staphylococcalcassette c虹omosomemec簡稱seemec側(cè)面DM的特有片段上。seemec是一個攜帶mec基因復(fù)合 體的可移動基因島genomicislands，GI，甲氧西林耐藥和其他抗生素耐藥基因在此不斷積 累，形成耐藥島resistanceisland,RI，導(dǎo)致MRSA對抗生素雙重耐藥。
[0006] 傳統(tǒng)細(xì)菌耐藥性方法雖然能夠滿足臨床的部分需要，但該些方法仍然存在一些缺 點，例如檢測時間較長和檢測結(jié)果不夠準(zhǔn)確等。因此，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，近年來 發(fā)展了一系列快速細(xì)菌鑒定或分子檢測技術(shù)，該類方法的特點是快速而準(zhǔn)確，一般在幾個 小時之內(nèi)就可W得到檢測結(jié)果，大大縮短了檢測時間。針對金黃色葡萄球菌和blaz相關(guān)基 因，研究人員已開展了常規(guī)PCR和巧光PCR方法研究，但常規(guī)PCR方法需要PCR擴增后進(jìn)行 電泳，不僅操作繁瑣，而且容易引起污染，還需要使用可能致癌的巧光燃料，而探針法巧光 PCR方法雖然靈敏準(zhǔn)確，但是其檢測成本較高，而且試劑有效期短，很容易降解。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種組分和配比合理，使 用方便，檢測快捷，準(zhǔn)確，適用于雙重巧光PCR檢測金黃色葡萄球菌及耐甲氧新林耐藥基因 blaz的試劑盒；
[0008] 本發(fā)明另一個目的是提供一種采用上述試劑盒檢測金黃色葡萄球菌及耐藥基因 blaz的方法，該方法操作簡便、快速，成本低，檢測結(jié)果準(zhǔn)確。
[0009] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用W下方案：
[0010] 一種檢測金黃色葡萄球菌及blaz用的引物，其特征在于該引物的序列分別為：
[0011] 上游引物gl巧F;TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
[001 引 下游引物gl巧R;GGATAATGAAGGGAAACC
[0013] 上游引物blazF;ACTTCAACACCTGCTGCTT
[0014] 下游引物blazR;ACTCTTGGCGGTTTCACT。
[0015] 一種檢測金黃色葡萄球菌及blaz用的試劑盒，其特征在于該試劑盒中20yL反應(yīng) 體系包括W下組分：
[0016]
[0017] 其中所述上游引物gl巧F的序列；TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
[001引 所述下游引物gl巧R的序列；GGATAATGAAGGGAAACC
[0019] 所述上游引物blazF的序列；ACTTCAACACCTGCTGCTT
[0020] 所述下游引物blazR的序列；ACTCTTGGCGGTTTCACT。
[0021] 如上所述的一種檢測金黃色葡萄球菌及blaz用的試劑盒，其特征在于該試劑盒 中20yL反應(yīng)體系包括W下組分：
[0022]
[0023] 一種檢測金黃色葡萄球菌及blaz的方法，其特征在于包括W下步驟：
[0024] A、提取樣品DNA;
[0025] B、利用如權(quán)利要求2或3所述的試劑盒對步驟A中的樣品DNA進(jìn)行PCR擴增；
[0026] C、擴增后對產(chǎn)物進(jìn)行高分辨率烙解曲線分析，并結(jié)合擴增曲線判定結(jié)果。
[0027] 如上所述檢測金黃色葡萄球菌及blaz的方法，其特征在于步驟B中PCR擴增的反 應(yīng)程序按W下步驟進(jìn)行：
[0028] (1)92°C~96°C預(yù)變性 30s;
[0029] (2)92°C~95°C變性 10s~30s，54°C~64°C退火 10s~30s，72°C10s~30s，共 進(jìn)行35~45個循環(huán)；
[0030] (3) 72°C延伸 10s~30s。
[0031] 如上所述檢測金黃色葡萄球菌及blaz的方法，其特征在于步驟C中所述高分辨率 烙解曲線分析，按W下步驟進(jìn)行：
[0032] (1)92°C~96°C變性Imin;
[0033] (2)40^復(fù)性1111111;
[0034](3)然后初始烙解溫度60°C~65°C，開始程序升溫烙解至90°C~95°C，并在烙解 過程中實時檢測巧光信號，15~25次/秒。
[00巧]如上所述檢測金黃色葡萄球菌及blaz的方法，其特征在于步驟A中所述提取樣品DNA的具體步驟如下；
[0036] 取1. 5血培養(yǎng)物1000化pm離屯、2min;沉淀物加入500yL的TE緩沖液，反復(fù)吹打 使之重新懸浮，800化/min離屯、3min，去盡上清，向沉淀中加入200y1的50mg/mL的溶菌 酶溶液30化10%SDS和15化的蛋白酶K，禍旋混勻后，于37°C溫育比；加入100化的 5mol/L化C1,充分混勻，再加入80ulCTAB/化C1溶液，混勻后再65°C溫育lOmin;加入等 體積的酪或氯仿或異戊醇混勻，離屯、4-5min，將上清轉(zhuǎn)入一只新管中，加入0. 8倍體積的異 丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來；沉淀用ImL的70%己醇洗漆后，加入TE溶液溶解沉淀。
[0037] 本發(fā)明中標(biāo)準(zhǔn)品模板的制備：
[0038] W常規(guī)PCR方法擴增耐藥基因目的基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %凝膠電泳分析，采用PCR 產(chǎn)物回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，將純化后的PCR產(chǎn)物與載體PMD18-T連接，將連接產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到單菌落，挑選單菌落至含抗生素的液體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)， 提取質(zhì)粒，W提取的重組質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR鑒定，并對重組質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定。提取 驗證正確的陽性重組質(zhì)粒，并測定其濃度，將其10倍倍比稀釋。
[0039] 本發(fā)明中敏感性和特異性試驗；
[0040] 采用測序等方法對陽性擴增產(chǎn)物進(jìn)行測序驗證，結(jié)果陽性擴增產(chǎn)物序列進(jìn)行 Blast比較時，序列均與Genbank目的序列高度同源。將10倍稀釋的陽性質(zhì)粒模板DNA加 入前述反應(yīng)體系，進(jìn)行敏感性實驗。結(jié)果各耐藥基因檢測靈敏度均低于0.Ipg，且具有很好 重復(fù)性。各耐藥基因稀釋模板濃度和Cp值之間呈良好的線性關(guān)系，R2均大于0. 95,說明該 方法具有較好的精確度和良好的穩(wěn)定性。
[0041] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有W下優(yōu)點：
[0042] 1)本發(fā)明試劑盒組分和配比合理，使用方便，檢測快捷，準(zhǔn)確，適用于巧光PCR檢 測金黃色葡萄球菌和blaz基因；
[0043] 2)本發(fā)明檢測方法簡化了檢測流程，大大縮短了檢測周期，檢測時間比傳統(tǒng)培養(yǎng) 分析方法縮短兩天左右；
[0044] 3)本發(fā)明檢測方法整個過程，PCR產(chǎn)物無需再轉(zhuǎn)入其它分析裝置，實現(xiàn)閉管操作， 避免交叉污染，而且可同時完成定量分析。
[0045] 4)采用本發(fā)明檢測方法同一反應(yīng)管即可實現(xiàn)同時金黃色葡萄球菌和blaz基因同 時檢測，操作簡便、快速，成本低，結(jié)果準(zhǔn)確。
【附圖說明】
[004引圖1;僅有金黃色葡萄球菌gl巧基因檢出的擴增曲線圖；
[0047]圖2;僅有金黃色葡萄球菌gl巧基因檢出的HRM分析圖；
[004引圖3;僅有耐藥基因blaz檢出的擴增曲線圖；
[0049] 圖4;僅有耐藥基因blaz檢出的的HRM分析圖；
[0050] 圖5 ;g；UB基因和blaz基因同時檢出的擴增曲線圖；
[0051] 圖6 ;gl巧基因和blaz基因同時檢出的HRM分析圖；
【具體實施方式】
[0052] 下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
[0053] 實施例1
[0054] 1、本發(fā)明一種檢測金黃色葡萄球菌及blaz用的引物，其中該引物的序列分別為： [00巧]上游引物gl巧F ;TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
[0056] 下游引物gl巧R ;GGATAATGAAGGGAAACC
[0057] 上游引物blazF ;ACTTCAACACCTGCTGCTT
[0058] 下游引物blazR ;ACTCTTGGCGGTTTCACT。
[00則 實施例2
[0060] 本發(fā)明一種檢測金黃色葡萄球菌及blaz用的試劑盒，其中該試劑盒中20 UL反應(yīng) 體系包括W下組分：
[0061]
[0062] 其中上下游引物序列為：
[0063] 上游引物gl巧F;TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
[0064] 下游引物gl巧R;GGATAATGAAGGGAAACC
[0065] 上游引物blazF;ACTTCAACACCTGCTGCTT
[0066] 下游引物blazR;ACTCTTGGCGGTTTCACT。
[0067] 實施例3
[0068] 本發(fā)明檢測金黃色葡萄球菌及blaz用的試劑盒，其中20.OuL
[0069] 反應(yīng)體系由W下組分組成：
[0070]
[ocm] 其中：
[0072] 其中引物序列如下：
[0073] 上游引物gl巧F;TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
[0074] 下游引物gl巧R;GGATAATGAAGGGAAACC [00巧]上游引物blazF;ACTTCAACACCTGCTGCTT
[0076] 下游引物blazR;ACTCTTGGCGGTTTCACT。
[0077] 實施例4
[0078] 本發(fā)明試劑盒中制備20uL反應(yīng)體系由W下組分組成：
[0079]
[0080]
[0081] 其中引物序列如下：
[0082] 上游引物 gl巧F;TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
[0083] 下游引物 gl巧R;GGATAATGAAGGGAAACC
[0084] 上游引物 blazF;ACTTCAACACCTGCTGCTT
[0085] 下游引物 blazR;ACTCTTGGCGGTTTCACT。
[008引 實施例5
[0087] 本發(fā)明試劑盒中制備20UL反應(yīng)體系由W下組分組成：
[0088]
[0089] 其中引物序列如下：
[0090] 上游引物 gl巧F;TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
[0091]