同時(shí)檢測(cè)xrcc1、ercc1和gstp1基因多態(tài)性的引物與方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種同時(shí)檢測(cè)XRCC1、ERCC1和GSTP1基 因多態(tài)性的引物與方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 銷(xiāo)類(lèi)抗癌藥物，包括順?shù)N、卡銷(xiāo)和奧沙利銷(xiāo)等，是目前臨床應(yīng)用中對(duì)多種癌癥具 有較高活性的抗癌藥物，主要通過(guò)引起細(xì)胞內(nèi)DNA損傷來(lái)清除癌細(xì)胞。
[0003]X線(xiàn)修復(fù)交叉互補(bǔ)基團(tuán)UXRCC1)，位于人類(lèi)染色體19ql3. 2-13. 3,大小為33化。 切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因UERCC1)，為人類(lèi)DNA損傷修復(fù)基因，位于染色體19ql3. 2-13. 3。谷 脫甘膚S轉(zhuǎn)移酶Pl(GSTPl)，谷脫甘膚S轉(zhuǎn)移酶（GST)是體內(nèi)最重要的II相代謝酶，通過(guò)直 接結(jié)合化學(xué)致癌物或通過(guò)與谷脫甘膚結(jié)合而發(fā)揮解毒功能，可降解外源性化合物毒性。
[0004] 現(xiàn)有研究數(shù)據(jù)顯示，XRCC1_R399QR/R，R/Q和Q/Q基因型頻率分別約為55%，37%， 8〇/〇 ;ERCC1_C118TC/C，C/T，T/T基因型頻率分別約為 52. 6%，43. 1%，4. 2% ;GSTP1_1105V Ile/lle(I/I)，Ile/Val(I/V)，Val/Val(V/V)基因型頻率分別為 57. 4%，35. 9%，6. 7〇/〇。
[0005] 因此，通過(guò)XRCCl/ERCCl/GSTPl基因多態(tài)性的檢測(cè)，有助于預(yù)測(cè)銷(xiāo)類(lèi)藥物化療的 預(yù)后，在幫助指導(dǎo)用藥和個(gè)性化治療方面具有重要意義?，F(xiàn)有技術(shù)缺少一種特異性好、靈敏 度高、可實(shí)現(xiàn)多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)的XRCCl/ERCCl/GSTPl基因多態(tài)性檢測(cè)引物及其方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種同時(shí)檢測(cè)XRCCl/ERCCl/GSTPl基 因多態(tài)性的引物與方法，具有特異性好、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了XRCC1/ERCC1/ GSTP1基因多態(tài)性的同時(shí)檢測(cè)。本發(fā)明同時(shí)檢測(cè)的位點(diǎn)包括XRCC1_R399Q;c. 1196A〉G(P. Gln399Arg)(SNP；rs25487),ERCC1_C118T；c.354T>C(p.Asnll8=)(SNP；rsll615),GSTP1_ I105V;c.313A〉G(p.IlelOSVal)(SNP;rsl695)。
[0007] 本發(fā)明提供一種同時(shí)檢測(cè)XRCCl/ERCCl/GSTPl基因多態(tài)性的引物，包括PCR擴(kuò) 增引物和SNaPshotPCR引物；所述PCR擴(kuò)增引物包括：針對(duì)XRCC1_R399Q的上游引物 5，-TCTGACTCCCCTCCAGATT-3'（SEQIDNO. 1)和下游引物5'-GCCCCTCAGATCACACCTA-3'（SEQ IDNO. 2)，針對(duì)ERCC1_C118T的上游弓I物 5' -TCCAGAACACTGGGACATGA-3'（沈QID NO. 3)和下游引物 5'-TCCCTATTGATGGCTTCTGC-3'（SEQIDNO. 4)，針對(duì)GSTP1_ I105V的上游引物 5'-ACCCCAGGGCTCTATGGGAA-3'（SEQIDNO. 5)和下游引物 5'-TGAGGGCACAAGAAGCCCCT-3'（SEQIDNO. 6);所述SNaPshotPCR引物包括；針對(duì)XRCC1_ R399Q的SNaPshotPCR引物 5'-CGTCGGCGGCTGCCCTCCC-3'（SEQIDNO. 7)，針對(duì)ERCC1_ C118T的SNaPshotPCR引物 5，-TTTTTTTTAGGGGCAATCCCGTACTGAAGTTCGTGCGCAA-3,（沈QID NO. 8)，針對(duì)GSTP1_I105V的SNaPshotPCR引物 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGTGGAGGACC TCCGCTGCAAATAC-3'（SEQIDNO. 9)。
[000引采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明提供的同時(shí)檢測(cè)XRCCl/ERCCl/GSTPl基因多態(tài)性的引 物，可W實(shí)現(xiàn)XRCCl/ERCCl/GSTPl基因多態(tài)性的特異性檢測(cè)，不會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)，準(zhǔn)確性 好。
[0009] 優(yōu)選地，所述？〇?擴(kuò)增引物中，《賄(：1_1?3999、6賄(：1_(：1181'和651口1_1105￥的引物 濃度比為 1 ;1 ;1;所述SNaPshotPCR引物中，XRCC1_R399Q、ERCC1_C118T和GSTP1_I105V 的引物濃度比為1 ;1 ;1。
[0010] 相應(yīng)地，本發(fā)明還提供一種同時(shí)檢測(cè)XRCC1/ERCC1/GSTP1基因多態(tài)性的方法，包 括如下步驟;A)提取DNA樣品；B)采用權(quán)利要求1或2中所述的PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行多重 PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化；C)采用權(quán)利要求1或2中所述的SNaPshotPCR引物進(jìn)行 SNaPshotPCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化；D)毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分 析，確定SNP位點(diǎn)及其基因型。
[0011] 優(yōu)選地，所述步驟A)中的DNA樣品為邸TA抗凝外周血的DNA樣品。
[0012] 優(yōu)選地，所述步驟B)中的多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括；階段1 ;98°C 3min ;階段2 : 981：1〇3;階段3;581：3〇3;階段4;721：1111111;階段5;返回到階段2,29個(gè)循環(huán)；階段6; 72°C 5min;階段7;25°C保溫。即，St巧1:98。C for 3minutes;St巧2:98。C for 10 seconds ；Step 3；58° C for 30 seconds ；Step 4；72° C for 1 minute ；Step 5 ；Go to step 2, 29 times ；Step 6；72° C for 5 minutes ；Step 7；25° C forever。
[0013] 所述步驟C)中的SNaPshot PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括；階段1 ;96°C 10s ;階段2 : 55°C 5s ;階段3 ;60°C 30s ;階段4 ;返回到階段1，25個(gè)循環(huán)；階段5 ;4°C保溫。目P，St巧 1；96° C forlOseconds ；Step 2；55° C for 5 seconds ；Step 3；60° C for SOseconds； Step 4 ；Go to step 1,25 times ；Step 5:4° C forever。
[0014] 優(yōu)選地，所述步驟D)中，采用GE肥MAP陽(yáng)RIDV4. 1軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。
[0015] 此外，本發(fā)明還提供同時(shí)檢測(cè)XRCC1/ERCC1/GSTP1基因多態(tài)性的引物在制備檢測(cè) XRCC1 /ERCC1 /GSTP1基因多態(tài)性試劑中的用途。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是；本發(fā)明提供了 一種同時(shí)檢測(cè)XRCC1/ ERCC1/GSTP1基因多態(tài)性的引物，引物的特異性好，不會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)，準(zhǔn)確性好，實(shí)現(xiàn)了 XRCC1/ERCC1/GSTP1基因多態(tài)性的同時(shí)檢測(cè)，提高了檢測(cè)效率。此外，本發(fā)明還提供了一種 同時(shí)檢測(cè)XRCC1/ERCC1/GSTP1基因多態(tài)性的SNaPshot法，通過(guò)使用特異性的PCR擴(kuò)增引物 和SNaPshotPCR引物，具有特異性好、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，可W為銷(xiāo)類(lèi)藥物的臨床 用藥提供指導(dǎo)。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1本發(fā)明提供的XRCC1/ERCC1基因引物的擴(kuò)增片段。
[0018] 圖2本發(fā)明提供的GSTP1基因引物的擴(kuò)增片段。
[0019] 圖3XRCC1/ERCC1基因引物擴(kuò)增產(chǎn)物的部分測(cè)序圖。
[0020] 圖4GSTP1基因引物擴(kuò)增產(chǎn)物的部分測(cè)序圖。
[0021] 圖5樣品的XRCC1/ERCC1/GSTP1基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[002引實(shí)施例一引物 發(fā)明人針對(duì)XRCC1/ERCC1/GSTP1的基因多態(tài)性位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了大量引物，通過(guò)引物反應(yīng) 條件的優(yōu)化和比較，篩選出了特異性好、不會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)且PCR反應(yīng)條件非常接近的引 物。本發(fā)明提供的引物包括PCR擴(kuò)增引物和SNaPshot PCR引物，PCR擴(kuò)增引物和SNaPshot PCR引物是相對(duì)應(yīng)的。本發(fā)明提供的所有引物序列均通過(guò)UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，無(wú)已知SNP位 點(diǎn)。
[0024]
實(shí)施例二引物的特異性 將本發(fā)明提供的引物于UCSC中進(jìn)行Blasting, XRCC1_R399Q引物擴(kuò)增片段 位于chrl9: 44055651-44055888,長(zhǎng)度為238bp ;ERCC1_C118T引物擴(kuò)增片段位于 C虹19: 45923504-45923722,長(zhǎng)度為219bp ;GSTP1_I105V引物擴(kuò)增片段位于chrll: 67352602-67352777,長(zhǎng)度為17化P;結(jié)果如圖1至圖2所示，所有引物的擴(kuò)增片段均覆蓋了 相應(yīng)的檢測(cè)位點(diǎn)，無(wú)其它同源基因。
[00巧]使用表1中PCR擴(kuò)增引物分別對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行擴(kuò)增及Sanger測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯 示，各引物擴(kuò)增片段與XRCC1/ERCC1/GSTP1基因參考序列吻合，結(jié)果如圖3至圖4所示。使 用表1中SNaPshot PCR引物，SNaPshot法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示。從圖5可知，各產(chǎn) 物峰的相對(duì)位置及測(cè)序反應(yīng)滲入的堿基與預(yù)期相符，且無(wú)其它干擾峰。
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