的制備
[0180] 為變體的最佳表達(dá)，后者和野生型分子也在化tiOlO載體中制備。
[01 引]使用PCEP4-FXWT4服-gs載體，W5'FXWT和 3'RC-Swal引物通過PCR(kapaHifi;Biosystems)擴(kuò)增FXWT4服序列的cDNA。
[0182] 使用Nucleospinextract純化1551-bp的PCR產(chǎn)物，然后使用MieI和Swal酶消 化，就像化tiCHO目的載體一樣。消化后將它們再次在NucleospinExtract上進(jìn)行純化。
[0183] 使用T4連接酶將插入片段和載體連接在一起，然后將連接產(chǎn)物整合到感受態(tài) ToplO細(xì)菌中。在氨節(jié)青霉素的存在下擴(kuò)增細(xì)菌后，細(xì)菌菌落從培養(yǎng)皿取樣并使用5'efla 和3巧引物通過PCR篩選W捜索296-bp的擴(kuò)增子，所述擴(kuò)增子是編碼巧的插入片段在 化tiC冊載體中存在的標(biāo)志。通過用化eI和Swal酶酶促消化篩選經(jīng)純化的載體W在瓊 脂糖凝膠上尋找1538-bp片段來對PCR篩選補(bǔ)充。用W下引物對化tiCH0-FXWT4服載體測 序：
[0184] -5'efla;5' -GTGGAGACTGAAGTTAGGCCAG-3'（沈QIDNo. 38)
[0185] -3巧；5' -CTTCATTTCCTCCAGGAAAGAGTTGGC-3'（SEQIDNo. 39)
[0186] -2BGHPA;5'-CAGATGGCTGGCAACTAGAA-3'(沈QIDNo. 40)
[0187] 2. 3.族1變體的制備
[0188] 根據(jù)表1通過裝配PCR并連接，或通過In化Sion技術(shù)使用在表2中列出的引物，進(jìn) 行編碼族1變體的cDNA的插入片段的制備。PCR1和2中使用的模板是化tiC冊-FXWT4服 載體。將PCR產(chǎn)物用化nl處理W消化親本DNA。用Nucleospinextract純化目標(biāo)擴(kuò)增子。
[0189]對于OptiCHO-FXWTFlD，0ptiCH0-FXWTF1G和OptiCHO-FXWTF1I分子，使用來自 PCR1和2的純化的擴(kuò)增子作為模板并通過裝配PCR根據(jù)表1裝配。通過用T4連接酶連接 來裝配純化的PCR3擴(kuò)增子和用化eI和Swal消化的載體。
[0190]表1
[0191]
[019引表2[0193]
[0194]
[0195]對于OptiCHO-FXWTFla，OptiCHO-FXWTF化，OptiCHO-FXWTFlc，OptiCHO-FX WTFle，OptiCHO-FXWTFlf和OptiCHO-FXWTFlh分子，通過根據(jù)表3的條件的PCR生成來 自PCR1和2的純化的擴(kuò)增子。通過與用化el和Swal預(yù)消化并使用NucleospinExtract 純化的載體In化Sion來裝配PCR1和2的純化的擴(kuò)增子。
[0196]表3;
[0197]
[0198] 對于每個(gè)變體，通過細(xì)菌轉(zhuǎn)化入ToplO細(xì)菌插入最終載體。在氨節(jié)青霉素的存 在下擴(kuò)增細(xì)菌后，細(xì)菌菌落從培養(yǎng)皿取樣并使用5'efla和3巧引物通過PCR篩選W捜索 296-bp的擴(kuò)增子，所述擴(kuò)增子是編碼巧的插入片段在化tiC冊載體中存在的標(biāo)志。用W下 引物對OptiCHO-FXWTFla至OptiCHO-FXWTFli載體測序；
[0199] -5'efla
[0200] -2BGHPA。
[0201] 2. 4族2變體的制備
[020引根據(jù)表4通過PCR技術(shù)并通過In化Sion使用在表2中列出的引物，進(jìn)行編碼族2 變體的cDNA的插入片段的制備。用于PCR1和2的模板是化tiCH0-FXWT4服載體。將PCR 產(chǎn)物用化nl處理W消化親本DNA。用Nucleospinextract純化擴(kuò)增子。通過與用化el和 Swal預(yù)消化并使用NucleospinExtract純化的OptiCHO載體Infusion來裝配PCR1和2 的純化的擴(kuò)增子。
[020引 表4 ;
[0204]
[0205] 對于每個(gè)變體，通過細(xì)菌轉(zhuǎn)化入ToplO細(xì)菌插入最終載體。在氨節(jié)青霉素的存 在下擴(kuò)增細(xì)菌后，細(xì)菌菌落從培養(yǎng)皿取樣并使用5'efla和3巧引物通過PCR篩選W捜索 296-bp的擴(kuò)增子，所述擴(kuò)增子是編碼巧的插入片段在化tiC冊載體中存在的標(biāo)志。用W下 引物對OptiCHO-FXWTF2a到OptiCHO-FXWT巧i載體測序；
[0206] -5'efla
[0207] -2BGHPA。
[0208] 2. 5.-制備的族3變體
[0209] 族3含有在激活膚中的缺失，所述缺失必須在其中能夠插入酶促切割位點(diǎn)之前制 備。在此方面，制備了兩個(gè)中間體載體，化tiCHOFXWTF3AD用于族3變體F3a到F3d，W及 OptiCHOFXWTF3EI用于族 3 變體F3e到F3i。
[0210] 使用Optic冊FXWT4服-gs載體作為模板和表2中所列的5'FXWT，3' 巧-SwaI， 3FXF3，5FXF3，3FXF3biS和5FXF3biS引物，根據(jù)表5通過裝配PCR構(gòu)建中間體載體的插入片 段。
[0211]表5;
[0212]
[0213] 使用Nucleospinextract純化裝配PCR的產(chǎn)物，然后純化所述產(chǎn)物，就像Optic冊 目的載體一樣，使用化el和Swal酶。消化后將它們再次在Nucleospinextract上進(jìn)行純 化。
[0214] 使用T4連接酶將插入片段和載體連接在一起，然后將連接產(chǎn)物整合到感受態(tài) ToplO細(xì)菌中。在氨節(jié)青霉素的存在下擴(kuò)增細(xì)菌后，細(xì)菌菌落從培養(yǎng)皿取樣并使用5'efla 和3巧引物通過PCR篩選W捜索296-bp的擴(kuò)增子，所述擴(kuò)增子是編碼巧的插入片段在 化tiCHO載體中存在的標(biāo)志。
[02巧]用W下引物對OptiCHOFXWTF3AD和OptiCHOFXWTF3EI中間體載體測序：
[0216] -5'efla
[0217] - 3巧 [021 引-2BGHPA.
[0219] 例外的是化tiCHOFXWTF3A分子，根據(jù)表6通過裝配PCR使用在表2中列出的引 物，進(jìn)行編碼系列3變體的cDNA的插入片段的制備。用于PCR1和2的模板是化tiCHO-FXWT F3AD載體用于族3變體F3a至F3d，和OptiCHOFXWTF3EI用于族3變體F3e至F3i。 用Nucleospinextract純化擴(kuò)增子。通過用W化日1和Swal預(yù)消化并使用Nucleospin extract純化的化tiC冊載體裝配PCR來裝配PCR1和2的純化的擴(kuò)增子。
[0220] 表 6 ;
[0221]
[0222] 使用Nucleospinextract純化裝配PCR的產(chǎn)物，然后純化所述產(chǎn)物，就像Optic冊 目的載體一樣，使用化el和Swal酶。消化后將它們再次在Nucleospinextract上進(jìn)行純 化。
[0223] 使用T4連接酶將插入片段和載體連接在一起，然后將連接產(chǎn)物插入感受態(tài)ToplO 細(xì)菌中。在氨節(jié)青霉素的存在下擴(kuò)增細(xì)菌后，細(xì)菌菌落從培養(yǎng)皿取樣并使用5'efla和3巧 引物通過PCR篩選W捜索296-bp的擴(kuò)增子，所述擴(kuò)增子是編碼巧的插入片段在化tiC冊 載體中存在的標(biāo)志。
[0224] 用W下引物對最終族3載體進(jìn)行測序：
[0225] -5'efla
[0226] -2BGHPA
[0227] 實(shí)施例2 ;重組因子X的生產(chǎn)
[022引 1-實(shí)驗(yàn)方案
[0229] 1. 1-試劑
[0230]ProCH04(Lonza)和化eest}de?F17(GIBC0)培養(yǎng)基。
[0231] 1^-谷氨酷胺（Gibco)。
[023引 CH0-S細(xì)胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基；Opti-ProSFM(Gibco)。
[0233] 肥K細(xì)胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基；Opti-MEM(Gibco)。
[0234]維生素K1 (Sigma)。
[0235] 1. 2 -方案
[0236] 在CH0-S或肥K-293-Freest}de真核細(xì)胞（Invitrogen)中W瞬時(shí)表達(dá)生產(chǎn)野生 型因子X和其變體。
[0237]CH0-S細(xì)胞在ProCH04介質(zhì)中培養(yǎng)，肥K293F細(xì)胞在F17介質(zhì)中培養(yǎng)，分別補(bǔ)充有 4mM和82mM的心谷氨酷胺。兩種細(xì)胞系在37°C下在受控的氣室中巧％C〇2)W135巧m震 蕩的條件下培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染日的前一天，將W7Xl〇5個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種細(xì)胞。
[0238] 在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，將DNA(20-30yg)和30yg轉(zhuǎn)染劑（TA)單獨(dú)在CH0-S的Opti-Pro培 養(yǎng)基和肥K293F的化ti-MEM培養(yǎng)基中預(yù)解育5分鐘，然后混合并解育20分鐘W允許DNA/ TA復(fù)合物的形成。整個(gè)系統(tǒng)添加到30毫升體積的1X1〇6個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞制物中。
[0239] 在使用天然維生素K環(huán)氧化物還原酶（VK0R)共轉(zhuǎn)染巧的情況下，兩種載體W多 種比例加入W獲得DNA的總量為20-30yg。VK0R酶使得在肥K中制造有活性的巧同時(shí)優(yōu) 化的丫-駿化。轉(zhuǎn)染后，將維生素KU5yg/ml)立即加入到培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染后的第一天對 轉(zhuǎn)染水平進(jìn)行評估，使用表達(dá)GFP(綠色巧光蛋白）的對照質(zhì)粒。批次"模式進(jìn)行生產(chǎn) 7天。在生產(chǎn)結(jié)束時(shí)，通過離屯、分離細(xì)胞和上清。將細(xì)胞除去并過濾上清，然后冷凍。
[0240] 實(shí)施例3;因子X濃度的測量
[0241] 1-實(shí)驗(yàn)方案
[0242] 借助商用ELISAZymutestFactorX(Hy地enBiomed)根據(jù)制造商的建議來測定 因子X濃度。一式=份地測量濃度，使用位于測定法的檢測的線性區(qū)域的抗原值。為了確 保引入的突變不破壞濃度的測量，巧W相等量沉積并通過使用與ELISA中所用的不同的多 克隆抗體的免疫印跡（抗人巧多克隆抗體（化yop巧貨號PAHFX-S))或通過SDS-PAGE后 染色顯示（數(shù)據(jù)未顯示）。
[0243] 2-結(jié)果
[0244] 2. 1-在CH0中瞬時(shí)表達(dá)的因子X變體的表達(dá)
[024引通過使用商用ELISAZymutestFactorX測量在轉(zhuǎn)染了編碼族1至3的cDNA的CH0-S細(xì)胞的上清中存在的因子X(巧）變體的濃度（圖3)。
[0246] 正如所料，未轉(zhuǎn)染的（對照）C冊細(xì)胞的上清不含有巧。用編碼多種巧的載體轉(zhuǎn) 染使得能夠得到范圍從0. 5至3. 06yg/ml的水平。多個(gè)族的巧的表達(dá)沒有大的區(qū)別。至 多，族3的巧-Ila表達(dá)化64yg/ml)比族1的表達(dá)（1. 26yg/ml)強(qiáng)2. 1倍。一些構(gòu)建體 使得能夠獲得濃度高于野生型因子X的因子X;它們是巧-Ila族（族3)和巧-PAR1 (族1 和3)構(gòu)建體。巧-Kal3似乎降低巧生產(chǎn)。
[0247] 2. 2-在肥K中瞬時(shí)表達(dá)的因子X變體的表達(dá)
[024引通過使用商用ELISAZymutestFactorX測量在轉(zhuǎn)染了編碼族1至3的cDNA的 肥K293S細(xì)胞的上清中存在的因子X變體的濃度（圖4)。正如所料，未轉(zhuǎn)染的（對照） 肥K293S細(xì)胞的上清不含有巧。族1分子W接近巧-WT的水平生產(chǎn)（從0. 14至1. 64yg/ ml)。僅巧-PARI分子W較高的水平生產(chǎn)。巧-Kal3分子保持是最少生產(chǎn)的分子。族2W對 所有構(gòu)建體類似的方式生產(chǎn)，表達(dá)值為從1. 79至2. 54yg/ml除了巧-Kal3構(gòu)建體W較低 水平生產(chǎn)化66yg/ml)。族3W從0. 2至1. 2yg/ml的較低的水平生產(chǎn)。
[0249] 結(jié)論是，某些因子X變體構(gòu)建體使得W比巧-WT更高的水平生產(chǎn)巧成為可能：
[0巧0]-該些是，在C冊細(xì)胞中，巧-Ila(族扣和巧-PAR1 (族1和扣構(gòu)建體和 [0巧^ -在肥K細(xì)胞中，族1的巧-PAR1。
[0巧引實(shí)施例4 ;在C冊-S中產(chǎn)生的因子X變體的凝血活性測量 [0巧3] 1-實(shí)驗(yàn)方案
[0巧4] 使用Star automated device (Stago)在KK-缺陷血漿存在的條件下測量由CH0-S 細(xì)胞生產(chǎn)的巧變體的精確計(jì)時(shí)活性。巧-缺陷血漿，neoplastin和Owren-Koller緩沖液 來自Stago(Asni紅es，法國）。
[0巧5] 濃縮的培養(yǎng)上清液在Owren-Koller緩沖液中稀釋到1/10,然后添加到巧缺陷血 漿。將混合物在37°C解育240秒，然后通過添加100y1neoplastin啟動凝血酶原時(shí)間 (PT)。
[0巧6] 將凝血時(shí)間（S)轉(zhuǎn)換成巧的比活性。
[0巧7] 2-結(jié)果
[0258] 評價(jià)從C冊中的多次轉(zhuǎn)染所得的濃縮的上清補(bǔ)償因子X缺陷的能力。將上清在巧 缺陷血漿中解育，并進(jìn)行PT測試。將凝血時(shí)間（S)轉(zhuǎn)換為比活性（SA;秒每微克蛋白），然 后計(jì)算比活性與野生型巧相比的百分比（圖5)。多個(gè)族之間的結(jié)果是一致的。該一結(jié)果 表明，行為差異主要源于切割位點(diǎn)而不是它們克隆的方式。
[0巧9] 構(gòu)建體可W分為S類：第一類中，其SA類似于巧-WT(含有巧-對照+)，第二類中， 其SA與對照相比降低（含有巧-Ila、巧-PARK巧-PAR1M和巧-Kal3)W及第S類別，其活 性在缺乏巧時(shí)大于巧-WT(含有巧-FXIa1和2、巧-KAL1和2)。應(yīng)當(dāng)注意的是JX-Kal2 族3構(gòu)建體因技術(shù)原因不能分析（圖上的*)。
[0260] 該些結(jié)果表明，引入并且形成族3的修飾（巧-FXIa1和2、巧-KALI和2)對因子 X分子，賦予在缺乏內(nèi)源性因子X時(shí)比野生型因子X更有效的凝血能力。
[026。 實(shí)施例5 ;CH0-S中產(chǎn)生的因子X變體通過RVV-X毒液