用于核酸測定的對照的制作方法
【專利說明】用于核酸測定的對照
[00(川相關申請 該申請要求享有對2012年8月30日提交的美國臨時申請?zhí)?1/695, 116的優(yōu)先權(quán)。該 申請的內(nèi)容在此通過引用W其整體并入本文。
[000引序列表的并入 于2013年8月30日創(chuàng)建并且大小為1邸、命名為"41432-508001W0_ST25.txt"的文 本文件的內(nèi)容，在此通過引用W其整體并入本文。 發(fā)明領域
[0003] 本發(fā)明設及通過在分離或提取方法的不同步驟中使用對照顆粒從微泡 (microvesicle)分離微泡級分和核酸的試劑盒和方法。
[0004] 背景 將通過細胞釋放的膜結(jié)合小泡描述為"微泡"。微泡可W包括外來體、外來體樣顆 粒、前列腺小體、外泌體（dexosomes)、腫瘤細胞胞外體（texosomes)、核外顆粒體、核內(nèi)體 (oncosomes)、調(diào)亡小體、逆轉(zhuǎn)錄樣顆粒和人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（肥RV)顆粒。研究已經(jīng)顯示 處于正常和病理狀況的多種不同細胞類型釋放微泡（The巧等，2002)。重要地，已經(jīng)顯示 微泡含有DNA、RNA和蛋白質(zhì)。最近的研究已經(jīng)顯示微泡的內(nèi)容物的分析已經(jīng)揭示生物標記 物或疾病相關基因可W被檢測，因此，證明了微泡分析用于幫助對疾病或其它內(nèi)科疾病的 診斷、預后、監(jiān)測或治療選擇上的價值。
[0005] 使用了多種分子診斷測定，W檢測疾病相關生物標記物，并且為患者、醫(yī)生、臨床 醫(yī)師和研究者提供了有價值的信息。用于診斷目的的從微泡提取的核酸的分析由于其非 侵入的性質(zhì)（微泡可W容易地收集到其中）而具有廣范的影響。微泡分析的使用替代侵入 性活組織檢查（invasivetissuebiopsy)會積極影響患者福利，改善進行縱向疾病監(jiān)測的 能力，并且改善獲得表達概況的能力，即使在當組織細胞不容易得到時(例如，在卵巢癌和 腦癌患者中）。因此，需要開發(fā)額外的工具W確保在臨床領域使用的診斷性微泡分析的一致 性、可靠性和適用性。沒有適當?shù)膬?nèi)部對照，核酸分析結(jié)果可能是不一致的并且因此對臨床 診斷不實用。為解決在微泡診斷領域內(nèi)的該需求，本發(fā)明提供了使用對照顆粒作為用于分 離微泡和/或從微泡提取核酸方法的內(nèi)部對照的方法和試劑盒。
[000引發(fā)明概述 本發(fā)明設及使用對照顆粒作為內(nèi)部對照，用于分離微泡和/或從微泡提取核酸的方 法，和可用于該方法的對照顆粒。特定地，本文中提供的方法對鑒別從分離的微泡中提取的 高質(zhì)量提取的核酸樣品有用，其適合用于進一步診斷或預后分析。
[0007] 本發(fā)明特征在于從生物樣品分離微泡和/或從微泡提取核酸的方法，其通過；a) 向生物樣品添加含有對照核酸的已知量的對照顆粒，b)從生物樣品分離級分，C)從級分提 取核酸，d)計算從分離和核酸提取步驟回收的對照顆粒的量，并且e)確定對照顆?；厥盏?量(在（d)中計算）是在預定數(shù)值范圍內(nèi)，W鑒別微泡分離和/或核酸提取的質(zhì)量。提取的 核酸包括來自微泡的核酸和來自對照顆粒的對照核酸。計算步驟可W包括確定對照顆粒的 對照核酸的表達水平或拷貝數(shù)量。在另一個實施方案中，對照顆?？蓋在微泡級分分離后 和核酸提取步驟之前添加至樣品。
[0008] 如果在步驟（d)中計算的對照顆粒的量在預定數(shù)值范圍內(nèi)，則微泡分離和/或核 酸提取的質(zhì)量是高的。如果在步驟（d)中計算的對照顆粒的量不在預定數(shù)值范圍內(nèi)（即，在 范圍之外)，則微泡分離和/或核酸提取的質(zhì)量是高的。
[0009] 預定數(shù)值范圍根據(jù)參考樣品（即，患者組群（patientcokxrt))的集合確定。例 如，計算來自參考樣品集合的全部回收的或檢測的對照核酸的表達水平（即，Ct值）的平均 值和標準偏差。預定數(shù)值范圍可W是，例如，距離參考樣品集合的回收的對照核酸的平均表 達水平（即，Ct值）1個標準偏差、2個標準偏差、3個標準偏差、4個標準偏差或5個標準偏 差。
[0010] 本發(fā)明提供了用于分離微泡和從分離微泡提取核酸的方法的內(nèi)部對照，W鑒別對 于疾病相關生物標記物的準確的和可靠的進一步分析為高質(zhì)量的提取的核酸樣品。例如， 對于與醫(yī)療狀況或疾病相關的至少一種生物標記物的存在、不存在或水平的改變，對提取 的核酸進一步分析，W診斷、預測或監(jiān)測疾病或醫(yī)療狀況。通過實時PCR(real-timePCR) 執(zhí)行對照核酸表達水平或至少一種生物標記物的存在、不存在或水平改變的分析。
[0011] 對照顆粒是病毒顆粒，諸如RNA瞻菌體。優(yōu)選地，對照顆粒是Q- 0瞻菌體。對照 核酸是編碼Q-0外殼蛋白的基因或其片段。對照顆?？蒞是天然生成的或重組的或工程 改造的病毒顆粒。
[0012] 生物樣品是體液。體液可W是從主體身體的任何部位分離的流體，優(yōu)選地外周位 置，包括但不限于，例如，血液、血漿、血清、尿液、疲、脊髓液、腦脊液、胸膜液、乳頭抽吸液、 淋己液、呼吸道，腸道和泌尿生殖道流體、淚液、唾液、乳汁、來自淋己系統(tǒng)流體、精液、腦脊 液、內(nèi)臟系統(tǒng)流體、腹水、腫瘤囊腫液、羊水和其組合。例如，體液是尿液、血液、血清或腦脊 液。
[001引在任何前述方法中，核酸是DNA或RNA。RNA的實例包括信使RNA、轉(zhuǎn)移RNA、核糖 體RNA、小RNA(非蛋白質(zhì)編碼RNA、非信使RNA)、微小RNA、piRNA、exRNA、snRNA和snoRNA。
[0014] 本發(fā)明提供了包含對照顆粒的用于從生物樣品分離微泡級分和/或微泡核酸，用 于與疾病或醫(yī)療狀況相關的至少一種生物標記物的檢測的試劑盒，其包括已知量的包含對 照核酸的對照顆粒，用于對照核酸雜交和擴增的引物，和任選地，用于生成標準曲線的一組 已知濃度的對照核酸，和任選地，在從生物樣品分離微泡級分中使用上述試劑的說明書。
[0015] 本發(fā)明同樣提供了用于確定從微泡級分的核酸提取和/或核酸提取的質(zhì)量的試 劑盒，其包括已知量的包含對照核酸的對照顆粒，用于對照核酸雜交和擴增的引物，和任選 地，用于生成標準曲線的一組已知濃度的對照核酸，和任選地，使用上述試劑用于確定從生 物樣品的微泡提取和/或核酸提取的質(zhì)量的說明書。
[0016] 本發(fā)明的多個方面和實施方案現(xiàn)在將詳細描述。將會理解的是可W在不偏離本發(fā) 明范圍的情況下進行細節(jié)的修飾。進一步的，除非上下文中另有要求，單數(shù)術語應當包括復 數(shù)并且復數(shù)術語應當包括單數(shù)。
[0017] 確定的全部專利、專利申請和出版物，為描述和公開目的明確通過引用并入本文， 例如，在該些出版物中描述的方法學可結(jié)合本發(fā)明使用。提供該些出版物僅由于它們在本 申請?zhí)峤蝗罩肮_。在該點上沒有任何情況應理解為承認發(fā)明人無權(quán)憑借在先發(fā)明或為 了任何其它理由先于該樣的公開。全部關于日期的聲明或關于該些文件內(nèi)容的表示是基 于對于申請人可W得到的信息，并且不應構(gòu)成對該些文件的日期和內(nèi)容的正確性的任何承 認。
[0018] 附圖簡述 圖1A是在血清樣品中Q-0外殼蛋白基因的RT-PCR分析中的擴增曲線繪圖。X軸代表PCR擴增循環(huán)的數(shù)量。Y軸代表標準化巧光，其指示了由給定的PCR條件集合產(chǎn)生的信號量 級。
[0019]圖1B是用于在RT-PCR分析中繪制在血清樣品中Q-0外殼蛋白基因的Ct值的標 準曲線。X軸代表每個反應拷貝數(shù)量的濃度。Y軸代表在RT-PCR分析中的Ct值。
[0020] 圖2A是在尿液樣品中Q-0外殼蛋白基因的RT-PCR分析中的擴增曲線繪圖。X軸 代表PCR擴增循環(huán)的數(shù)量。Y軸代表標準化巧光，其指示了由給定的PCR條件集合產(chǎn)生的信 號量級。
[002。圖2B是用于在RT-PCR分析中在尿液樣品中繪制Q-0外殼蛋白基因的Ct值的標 準曲線。X軸代表每個反應拷貝數(shù)量的濃度。Y軸代表在RT-PCR分析中Ct值。
[002引圖3A是在尿液樣品中白蛋白基因和18srRNA的RT-PCR分析中的擴增曲線繪圖。X軸代表PCR擴增循環(huán)的數(shù)量。Y軸代表標準化巧光，其指示了由給定的PCR條件集合產(chǎn)生 的信號量級。
[0023] 圖3B是在尿液樣品中GAPDH基因的RT-PCR分析的擴增曲線繪圖。X軸代表PCR 擴增循環(huán)的數(shù)量。Y軸代表標準化巧光，其指示了由給定的PCR條件集合產(chǎn)生的信號量級。
[0024] 圖4是通過連續(xù)去除具有高Q-0 Ct的樣品在樣品中關聯(lián)PCA3 AUC值的兩幅圖。 在上圖中，Y軸代表AUC值并且X軸代表通過減少Q(mào)-0至平均Q-0的距離(標準偏差）排 除的樣品。在下圖中，Y軸代表用作截止值的Q-0至平均值的距離(標準偏差)并且X軸代 表通過減少Q(mào)-0至平均Q-0的距離(標準偏差）排除的樣品。
[00幼發(fā)明詳述 本發(fā)明部分地基于下列發(fā)現(xiàn)；在用于從生物樣品中分離微泡和提取微泡核酸的方法中 可W使用Q-0瞻菌體作為對照顆粒。在分離和/或提取過程期間通常使用內(nèi)部對照W確 定方法的效率，或所獲得的分離或提取的質(zhì)量。本方法使用與微泡大小相似的對照顆粒(諸 如Q-P瞻菌體）作為微泡分離和從分離的微泡提取的核酸的效率、質(zhì)量或純度的對照。
[0026]由細胞釋放的直徑< 0.8化的全部囊泡在本文中共同地指的是微泡。該可W包括 外來體、外來體樣顆粒、前列腺小體、外泌體（dexosomes)、腫瘤細胞胞外體（texosomes)、 核外顆粒體、核內(nèi)體（oncosomes)、調(diào)亡小體、逆轉(zhuǎn)錄樣顆粒和人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（肥RV) 顆粒。對來自多種細胞來源的微泡關于蛋白質(zhì)和脂質(zhì)含量已經(jīng)進行了充分研究。
[0027] 微泡在先前已經(jīng)顯示出是有價值的診斷和預后工具。初步研究證明成膠質(zhì)細胞瘤 來源的微泡可W從成膠質(zhì)細胞瘤患者的血清中分離。重要地，該些微泡含有與腫瘤細胞相 關的mRNA。該些微泡中的核酸可W用作有價值的生物標記物，用于腫瘤診斷、表征和預后。 例如，通過分析隨時間或隨療程是否獲得了其它突變，可W使用微泡中的核酸監(jiān)測隨時間 的腫瘤進展。此外，可W同樣確定疾病相關基因的水平，并且編譯為基因表達概況，其可W 與參考概況相比較，W診斷或預測疾病或監(jiān)測疾病或治療方案的進程。
[0028] 本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn)；Q-0瞻菌體顆?？蒞在從生物樣品進行的微泡純化/分離 和微泡核酸提取的多個步驟中添加至樣品w充當內(nèi)部對照。因此，本發(fā)明提供了在從生物 樣品的微泡中提取核酸期間添加對照顆粒的方法，其中對照顆粒充當用于分離微泡和從其 中分離核酸的內(nèi)部對照。在一個方面，在純化微泡之前將對照顆粒添加至生物樣品。在另 一個方面，在核酸提取之前將對照顆粒添加至純化的微泡級分。微泡級分或提取的微泡核 酸的質(zhì)量或純度可W直接地影響用于疾病診斷