液驗(yàn)色為無(wú)色即說(shuō)明反應(yīng)完成。以上反應(yīng)即獲得X-Ph-Y-(B)n的親水偶聯(lián)肽鏈。
[0049]基于上述獲得的肽鏈，直接進(jìn)行[操作B]，并在后續(xù)步驟與[操作A]交替，直至獲 得王氏樹脂-難溶多肽鏈-連接臂-親水多肽鏈。
[0050] 然后用IOmlTFA:TIS:EDT= 95% :3% :2%裂解樹脂2小時(shí)，將偶聯(lián)肽鏈脫除保 護(hù)基團(tuán)。然后將樹脂濾除留下母液，加100mL乙醚析出多肽。用3000轉(zhuǎn)/秒離心2min，沉 淀得到粗品多肽，重復(fù)洗滌離心后在真空干燥機(jī)里干燥，獲得難溶多肽鏈-連接臂_親水多 肽鏈粗品。
[0051] 將上述粗品用水/乙腈的混合液體溶解，于高效液相色譜裝樣進(jìn)行分離提純，經(jīng) 過(guò)用H20/0. 1TFA%做水相，ACN/0. 1%TFA做有機(jī)相的梯度洗脫色譜體系分離提純，收集目 標(biāo)峰。把收集的目標(biāo)峰用分析性高效液相色譜檢測(cè)純度。合格的樣品用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，放 冰箱預(yù)凍成固體。最后放入真空冷凍干燥機(jī)凍干，獲得純品ILVLLIII-HMBA-DDDDDEEKEEEE。
[0052] 將上述純品用LiOH飽和溶液進(jìn)行酯鍵水解，常溫下反應(yīng)3小時(shí)后，目標(biāo)多肽鏈 ILVLLIII析出，而增加的序列HMBA-DDDDDEEKEEEE由于親水性強(qiáng)且整個(gè)多肽呈酸性，將溶 解在LiOH溶液中，然后將析出的目標(biāo)多肽經(jīng)過(guò)過(guò)濾凍干即可得到成品。
[0053] 上述反應(yīng)中，F(xiàn)moc氨基酸購(gòu)于吉爾生化，生產(chǎn)批號(hào)GLS141015-4071、DICHobt DMAP購(gòu)于蘇州昊帆、HMBA購(gòu)于吉爾生化，TFA、TIS、EDT、乙醚、哌啶、DMF均購(gòu)于南京晚晴。
[0054] 實(shí)施例2
[0055] 本實(shí)施例針對(duì)難溶多肽ILVLLIII進(jìn)行分離純化，連接臂選用4-(2-羥乙基）苯 甲酸（HPA)，通過(guò)連接臂連接RRRRREDKKKKK親水多肽鏈。其中，D表示天冬氨酸，疏水參 數(shù)-3. 5,利用OtBu保護(hù)官能團(tuán)；E表示谷氨酸，疏水參數(shù)-3. 5,利用OtBu保護(hù)官能團(tuán)；K表 示賴氨酸，疏水參數(shù)-3. 9,利用Boc保護(hù)官能團(tuán)，R表示精氨酸，疏水參數(shù)-4. 5,利用Pbf保 護(hù)官能團(tuán)；這些氨基酸都采用Fmoc保護(hù)a-氨基進(jìn)行固相合成。如圖2所示，具體合成步 驟如下：
[0056] 稱取IgFmoc-Lys(boc)-Wangresin樹脂，執(zhí)行[操作A]，即：加入哌啶：DMF= 1:4 (體積比）移除N端的Fmoc保護(hù)基團(tuán)，溫度控制在30°C，反應(yīng)20分鐘，反應(yīng)后利用DMF/ 甲醇各洗滌3次，利用茚三酮檢測(cè)試劑檢測(cè)，顏色為藍(lán)色表示反應(yīng)完全。
[0057] 然后執(zhí)行[操作B]，S卩：加入初始樹脂摩爾數(shù)兩倍的DIC和H0BT，以及兩倍量的具 有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸反應(yīng)1小時(shí)，溫度控制在30°C，反應(yīng)結(jié)束后用DMF洗滌3次后，用茚三 酮檢測(cè)顏色為無(wú)色，則說(shuō)明反應(yīng)完全。
[0058] 后續(xù)以[操作A]、[操作B]交替進(jìn)行，只是在[操作B]中所加入的親氨基酸 隨著合成順序的進(jìn)行更換。其中具有保護(hù)基團(tuán)的賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸分別 為Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH, 如此反應(yīng)直到連接完HPA，用茚三酮溶液驗(yàn)色為無(wú)色即說(shuō)明反應(yīng)完成。以上反應(yīng)即獲得 X-Ph-Y- (B)n的親水偶聯(lián)肽鏈。
[0059] 基于上述獲得的肽鏈，直接進(jìn)行[操作B]，并在后續(xù)步驟與[操作A]交替，直至獲 得王氏樹脂-難溶多肽鏈-連接臂-親水多肽鏈。
[0060] 然后用IOmlTFA:TIS:EDT= 95% :3% :2%裂解樹脂2小時(shí)，將偶聯(lián)肽鏈脫除保 護(hù)基團(tuán)。然后將樹脂濾除留下母液，加100mL乙醚析出多肽。用3000轉(zhuǎn)/秒離心2min，沉 淀得到粗品多肽，重復(fù)洗滌離心后在真空干燥機(jī)里干燥，獲得難溶多肽鏈-連接臂_親水多 肽鏈粗品。
[0061] 將上述粗品用水/乙腈的混合液體溶解，于高效液相色譜裝樣進(jìn)行分離提純，經(jīng) 過(guò)用H20/0. 1TFA%做水相，ACN/0. 1%TFA做有機(jī)相的梯度洗脫色譜體系分離提純，收集目 標(biāo)峰。把收集的目標(biāo)峰用分析性高效液相色譜檢測(cè)純度。合格的樣品用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，放 冰箱預(yù)凍成固體。最后放入真空冷凍干燥機(jī)凍干，獲得純品ILVLLIII-HPA-RRRRREDKKKKK。
[0062] 將上述純品用LiOH飽和溶液進(jìn)行酯鍵水解，常溫下反應(yīng)3小時(shí)后，目標(biāo)多肽鏈 ILVLLIII析出，而增加的序列HPA-RRRRREDKKKKK由于親水性強(qiáng)且整個(gè)多肽呈酸性，將溶解 在LiOH溶液中，然后將析出的目標(biāo)多肽經(jīng)過(guò)過(guò)濾凍干即可得到成品。
[0063] 試驗(yàn)例
[0064] 本試驗(yàn)針對(duì)各組的肽鏈分別評(píng)判其在DMF溶液、DMSO溶液、HPLC中ACN:H2O(1:3) 溶液、以及LiOH飽和溶液下，2mg/mL的溶解能力。上述實(shí)施例1、2中的難溶多肽鏈-連接 臂-親水多肽鏈分別作為組1、組2,單獨(dú)的難溶多肽鏈ILVLLIII作為對(duì)照組。如表3所 示：
[0065] 表3難溶多肽連處理后的溶解能力評(píng)價(jià)
[0066]
[0067] 目標(biāo)肽鏈的序列為：ILVLLIII，在DMF、DMS0和常用HPLC純化條件ACN=H2O= 1 :3 溶解后十分渾濁且有固體析出。ILVLLIII4-HMBA-DDDDDEEKEEEE在DMF、DMSO和常用HPLC純化條件ACN:H20(1:3)溶解后均十分清澈且無(wú)固體析出。而ILVLLIII-HPA-RRRRREDKKKKK 在ACN=H2O(1:3)中完全溶解，但在DMF和DMSO中仍有固形物析出。
[0068] 對(duì)于第一組和第二組的肽鏈溶解在LiOH飽和溶液中，要求最好加入的時(shí)候能完 全溶解，然后等反應(yīng)3小時(shí)后，難溶多肽鏈水解析出固體。而第二組的溶解效果顯然沒有第 一組好，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品產(chǎn)率下降?？梢姷谝唤M親水多肽鏈的氨基酸結(jié)構(gòu)更利于最后難溶多肽 鏈的析出。
[0069] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出：對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種溶解難溶多肽的偶聯(lián)肽鏈，其特征在于，該肽鏈如式（I)所示： X-Ph-Y-(B)n (I), 其中，Ph表示1，4位被取代的苯環(huán)； X表示羥基或C1-C4的單羥基烷基； Y表示與（B)n發(fā)生脫水縮合反應(yīng)后形成的羰基或C2~C4羰基烷基； (B)n表示n個(gè)相同或不同的親水氨基酸縮合組成的親水多肽鏈，n為難溶多肽氨基酸 數(shù)的1. 2~2倍。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種溶解難溶多肽的偶聯(lián)肽鏈，其特征在于： 所述 X 為直鏈或支鏈的-CH20H、-CH2CH20H、-CH2CH 2CH20H、-CH2CH2CH2CH 2OH 的任意 一種； 所述Y為直鏈或支鏈的- CH2CO-、- CH2CH2CO -或- CH2CH2CH2CO -的任意一種。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種溶解難溶多肽的偶聯(lián)肽鏈，其特征在于：所述X - Ph -Y來(lái)自4-羥基苯甲酸、對(duì)羥甲基苯甲酸、4-(2-羥乙基）苯甲酸、4-(3-羥基丙基）苯甲酸、 4-(4-羥基丁基）苯甲酸、對(duì)羥基苯乙酸、4-(羥甲基）苯乙酸、對(duì)羥基苯丙酸、3-[4-(羥基 甲基）苯基]丙酸、4-(4-羥基苯基）丁酸、2-(4-羥基苯）丙酸、3-(4-羥基苯基）丁酸、 2_[ (4-羥基苯基）甲基]氨基丁酸、4-(1-羥基乙基）-苯甲酸的任意一種。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種溶解難溶多肽的偶聯(lián)肽鏈，其特征在于：所述親水氨基 酸為精氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、組氨酸、脯氨酸的任意一種。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種溶解難溶多肽的偶聯(lián)肽鏈，其特征在于：所述谷氨酸和/ 或天冬氨酸總數(shù)目占總親水氨基酸數(shù)目的30%~80%。6. 如權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)肽鏈合肽鏈在液相色譜分離純化上的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種溶解難溶多肽的偶聯(lián)肽鏈及其在液相色譜中分離純化的應(yīng)用，屬于生物化學(xué)領(lǐng)域。利用特殊連接臂將親水多肽鏈與難溶多肽鏈連接，解決了難溶多肽鏈在液相色譜中無(wú)法操作的問(wèn)題，優(yōu)化了親水氨基酸的組合，然后利用酯鍵水解斷開難溶多肽鏈和親水多肽鏈，使目標(biāo)肽鏈直接析出，具有簡(jiǎn)易、高效的特點(diǎn)，用該方法獲得的難溶多肽產(chǎn)品完全可以達(dá)到客戶要求標(biāo)準(zhǔn)。
【IPC分類】C07K7/08, C07K1/16
【公開號(hào)】CN105001307
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510466145
【發(fā)明人】周彬, 查建生, 康武, 徐金榮, 潘奕
【申請(qǐng)人】南京斯拜科生化實(shí)業(yè)有限公司
【公開日】2015年10月28日
【申請(qǐng)日】2015年7月31日