耐久腸球菌素突變體及其編碼基因的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及食品領(lǐng)域，具體涉及耐久腸球菌素突變體及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002]乳酸菌細菌素是一類乳酸菌代謝過程中由核糖體合成并分泌到環(huán)境中具有抑菌活性的蛋白質(zhì)或多肽，在食品保藏中極具重要意義。自乳酸鏈球菌素Nisin商業(yè)應用以來，細菌素的研究開發(fā)一直是相關(guān)領(lǐng)域的熱點。耐久腸球菌素Durancin GL(GenBank:HQ696461.1)是從西班牙干酪中分離的耐久腸球菌41D株所產(chǎn)生的新型細菌素，尤其對李斯特菌等食源性人體致病菌具有革E向抑制作用(Du，Lihui，Somkuti, George A.，Renye, John A., Jr., Huo, Guicheng.Journal of Food Safety, 2012, 32(I):74-83.) 0 但是，耐久腸球菌素Durancin GL活性較低。耐久腸球菌素Durancin GL的生物合成基因(GenBank登錄號HQ696461.1)包括結(jié)構(gòu)基因(durA)和免疫基因(durB)，其中結(jié)構(gòu)基因編碼耐久腸球菌素Durancin GL前體，免疫基因編碼耐久腸球菌素Durancin GL的免疫蛋白以防止表達的細菌素對宿主的傷害。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供具有較高活性耐久腸球菌素突變體。
[0004]本發(fā)明的另一目的在于提供耐久腸球菌素突變體的編碼基因。
[0005]本發(fā)明的再一目的在于提供耐久腸球菌素突變體的制備方法及其在食品級防腐劑中的應用。
[0006]本發(fā)明的目的采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)。
[0007]耐久腸球菌素突變體，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:5所示。
[0008]本發(fā)明還要求保護所述耐久腸球菌素突變體的編碼基因。
[0009]優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述編碼基因的序列如SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:6所示。
[0010]本發(fā)明還要求保護含有所述編碼基因的表達盒、重組載體、重組菌或細胞系。
[0011]本發(fā)明還要求保護制備所述耐久腸球菌素突變體的方法，包括如下步驟:將攜帶有耐久腸球菌素突變體編碼基因的載體導入宿主菌，誘導所述宿主菌表達耐久腸球菌素突變體。
[0012]本發(fā)明還要求保護所述耐久腸球菌素突變體在制備食品級防腐劑方面的應用。
[0013]本發(fā)明耐久腸球菌素突變體K24A和K28A均具有較高活性和穩(wěn)定性，制備方法簡單，有望應用于食品級防腐劑。
【附圖說明】
[0014]圖1 突變質(zhì)粒 pGEX-durAB-K24A 的 PCR 鑒定電泳結(jié)果，M 為 DS 5000 DNA Marker,I為突變質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物。
[0015]圖 2 DE3-pGEX-durAB-K24A 的 PCR 鑒定電泳分析，M 為 DS 5000 DNA Marker，I 為DE3-pGEX-durAB-K24A 的 PCR 產(chǎn)物。
[0016]圖3耐久腸球菌素Durancin GL及其突變體的抑菌活性，I為耐久腸球菌素Durancin GL抑菌圈，2為耐久腸球菌素突變體K24A抑菌圈，3為耐久腸球菌素突變體K28A抑菌圈
[0017]圖4耐久腸球菌素突變體的穩(wěn)定性。
[0018]圖5耐久腸球菌素Durancin GL的穩(wěn)定性。
【具體實施方式】
[0019]以下通過實施例對本發(fā)明作進一步闡述。
[0020]實施例1
[0021]耐久腸球菌素Durancin GL成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。其前體帶有信號肽，編碼基因如SEQ ID NO:4所示。本實施例描述將SEQ ID NO:1中第24位的K(賴氨酸)采用A(丙氨酸)取代制備耐久腸球菌素突變體(命名為K24A)的具體方法。耐久腸球菌素突變體K24A的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，編碼基因的序列如SEQ ID NO: 3所示。
[0022]1.擴增細菌素融合基因片段
[0023]為了便于純化和表達，設(shè)計引物擴增制備由His標簽、腸激酶酶切位點、耐久腸球菌素Durancin GL的成熟肽編碼基因(SEQ ID NO: 4去除信號肽編碼序列后的第85-216位核苷酸片段)和免疫基因(durB，GenBank登錄號HQ696461.1)組成的細菌素融合基因片段。
[0024]針對耐久腸球菌素Durancin GL的成熟肽編碼基因和免疫基因序列，設(shè)計引物durl (SEQ ID NO: 7)和dur2 (SEQ ID NO: 8)，其中引物durl帶有His標簽和腸激酶酶切位點。
[0025]durl 的序列為:5，-GTGGGATCCC ACCATCATCA TCATCATGAC GACGACGACAAGGCAACTTA TTATGGAAAT GGTGTTTATT G-3’ ，
[0026]dur2 的序列為:5’-AAACTCGAGT TTAACTCCAA ATACCGATAG ACGCCCATCC CC-3’。
[0027]以耐久腸球菌41D株新鮮過夜培養(yǎng)菌液為模板，以durl和dur2為引物，擴增含有耐久腸球菌素Durancin GL的成熟肽編碼基因和免疫基因的細菌素融合基因片段。將
2.0 μ I耐久腸球菌41D株過夜培養(yǎng)的菌液與25.0 μ 1HS? Mix (購自TaKaRa)、1.0 μ I durl、1.0 μ I dur2 和 21.0 μ I ddH20 混合后，在 PCR 儀(Applied B1systems)中按照下列程序進行反應:升溫至95°C維持30s ;95°C變性15s，62°C退火20s，72°C延伸60S，反應30個循環(huán)；降溫至72°C維持7min。
[0028]2.構(gòu)建攜帶細菌素融合基因片段的重組載體
[0029]采用多功能DNA純化回收試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)將細菌素融合基因片段回收，然后與pEASY-Blunt Simple Cloning Vector(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)按照插入片段與線性載體物質(zhì)的量之比約為7:1混勻，置于25°C下反應約lOmin，獲得重組質(zhì)粒pEASY/durAB。
[0030]將重組質(zhì)粒pEASY/durAB 轉(zhuǎn)化到 Transl-TlCompetentE.coli (Transl-Tl 感受態(tài)E.coli，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)細胞中，大量培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒進行序列鑒定。從序列鑒定正確的菌株中擴增細菌素融合基因片段，并經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切，回收酶切片段。采用BamH I和Xho I雙酶切pGEX_6P_l質(zhì)粒(Invitrogen)，回收載體片段。將細菌素融合基因片段和載體的雙酶切片段進行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-durAB。
[0031]3.構(gòu)建表達耐久腸球菌素突變體的重組菌
[0032]設(shè)計突變引物K24A-F(SEQ ID NO:9)和 K24A_R(SEQ ID NO: 10)，具體序列如下:
[0033]K24A-F:
[0034]5， -GATTGGAATAAAGCTTCAGCAGAAATAGGAAAAATTATTG-3，，
[0035]K24A-R:
[0036]5’ -TGCTGAAGCTTTATTCCAATCTACCCAACATTCTTGTTTA-3’。
[0037]以重組質(zhì)粒pGEX-durAB為模板，以K24A-F和K24A-R為突變引物，采用MutExpress? II Fast Mutagenesis Kit (南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司)，將重組質(zhì)粒pGEX-durAB中耐久腸球菌素Durancin GL成熟肽編碼基因替換為突變體的編碼基因(SEQID N0:3)，得到突變質(zhì)粒，命名為pGEX-durAB-K24A，其PCR鑒定結(jié)果