TuVIPP1蛋白及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種TuVIPPI蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] VIPP(vesicle-induceingproteininplastids，質(zhì)體囊泡誘導(dǎo)生成蛋白）是一 種葉綠體定位蛋白，據(jù)報道在衣藻和擬南芥葉綠體內(nèi)膜、基質(zhì)和內(nèi)囊體膜上均有分布，vipp 基因缺失突變體存在內(nèi)囊體結(jié)構(gòu)嚴重缺陷，不能光合自養(yǎng)等表型。在主要農(nóng)作物中，VIPP基 因的功能還未見研究報道。
[0003] 近年來，利用模式植物（擬南芥）系統(tǒng)為手段，用來研究作物大豆、小麥等中的重 要基因的研究策略得到科學(xué)家們廣泛的應(yīng)用。根本原因在于作物基因組復(fù)雜，要想研究其 重要基因的功能周期長且工作難度大。因此以反向遺傳和模式植物為研究策略，以分子生 物學(xué)、遺傳學(xué)、細胞生物等研究技術(shù)為研究手段的實驗體系應(yīng)育而生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種TuVIPPI蛋白及其編碼基因。
[0005] 本發(fā)明提供的蛋白，命名為TuVIPPI蛋白，來源于小麥，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)：
[0006] 1)由序列表中序列2所示的氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；
[0007] 2)將序列表中序列2的氨基酸序列殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代 和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
[0008] 上述經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨 基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0009] 編碼上述蛋白的DNA分子也是本發(fā)明保護的范圍。
[0010] 上述DNA分子為如下1) 4)中任一所述的DNA分子：
[0011] 1)編碼區(qū)為序列表中序列1所示的核苷酸；
[0012] 2)編碼區(qū)為序列表中序列3所示的核苷酸；
[0013] 3)在嚴格條件下與1)雜交且編碼與上述蛋白具有相同功能蛋白的DNA分子；
[0014] 4)與1)具有90%以上同源性且編碼與上述蛋白具有相同功能蛋白的DNA分子。
[0015] 上述嚴格條件為在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0? 1 %SDS和IXSSC，0? 1 %SDS各洗膜一次。
[0016] 含有上述DNA分子的表達盒、重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌也是本發(fā) 明保護的范圍。
[0017] 上述重組載體為將上述DNA分子插入表達載體得到的重組載體。
[0018] 本發(fā)明的實施例中，重組載體將序列表中序列3所示的DNA分子插入pCAMBIA1300 載體的EcoRI和PstI酶切位點得到的載體，命名為TuVIPP10E-pCAMBIA1300。序列表中序 列3所示的DNA分子包括啟動子CaMV35S、基因TuVIPPI和終止子0CS，其中，啟動子CaMV35S 為序列表中序列3自5'末端第1-1427位核苷酸、基因TuVIPPI為序列表中序列3自5'末 端第1428-2429位核苷酸、終止子OCS為序列表中序列3自5'末端第2430-3207位核苷酸。
[0019] 上述的蛋白、上述DNA分子或上述的表達盒、重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或 重組菌在調(diào)控植物光合作用和/或使植物開花和/或使植物結(jié)實和/或使植物產(chǎn)生內(nèi)囊體 膜結(jié)構(gòu)和/或使白化植物變?yōu)榫G化植物中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。
[0020] 上述植物或所述白化植物均為擬南芥純合突變體Atvippl(-/_)。
[0021] 上述的蛋白、上述DNA分子或權(quán)利要求4所述的表達盒、重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因 細胞系或重組菌在培育具有如下1)_3)中至少一種特征的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用也是本發(fā) 明保護的范圍：1)綠化表型；2)開花和/或結(jié)實；3)產(chǎn)生內(nèi)囊體膜結(jié)構(gòu)。
[0022] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育開花和/或結(jié)實的轉(zhuǎn)基因擬南芥的方法。
[0023] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：
[0024] 1)將上述的DNA分子轉(zhuǎn)入雜合突變體AtvippK+/-)擬南芥中，得到轉(zhuǎn)基因擬南 芥；
[0025] 2)將轉(zhuǎn)基因擬南芥和雜合突變體Atvippl(+/_)播種培育后代，選取轉(zhuǎn)基因擬南 芥AtvippK-/-)基因型的后代；
[0026] 所述轉(zhuǎn)基因擬南芥Atvippl(-/_)基因型的后代具有如下A-C中至少一種表型：
[0027] A、所述轉(zhuǎn)基因擬南芥Atvippl(-/_)基因型的后代為綠化植物；
[0028] B、所述轉(zhuǎn)基因擬南芥Atvippl(-/_)基因型的后代能開花和/或結(jié)實；
[0029] C、所述轉(zhuǎn)基因擬南芥AtvippK-/-)基因型的后代產(chǎn)生內(nèi)囊體膜結(jié)構(gòu)。
[0030] Atvippl基因型通過如下方法鑒定：
[0031] AtTuV10E-f和AtTuV10E-f擴增 798bpTuVIPPI基因；
[0032] AtVIPPl-f和AtVIPPl-r擴增 669bp的野生型AtVIPPl條帶；
[0033] AtVIPPl-r和pCSA110LB3 擴增 525bpT-DNA插入片段；
[0034] 株系僅有525bp，為（-/-MtVIPPl基因型；
[0035] 株系有 669bp與 525bp，為（+/-MtVIPPl基因型；
[0036] 株系僅有669bp，為（+/+MtVIPPl基因型。
[0037] 株系有798bpTuVIPPI基因，為轉(zhuǎn)基因植物。
[0038] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明從二倍體烏拉爾圖小麥中克隆了TuVIPPI基因，并通 過轉(zhuǎn)基因互補擬南芥AtvipplT-DNA插入缺失突變體驗證了該基因在內(nèi)囊體發(fā)生中的關(guān)鍵 作用，可以促進植物光合作用，使白化植物綠化。
【附圖說明】
[0039] 圖1為TuVIPPlPCR產(chǎn)物電泳
[0040] 圖2為突變體MS平板上生長7天的幼苗表型觀察
[0041] 圖3為突變體播種2周表型觀察
[0042] 圖4為突變體植株P(guān)CR鑒定電泳圖
[0043] 圖5為TuVIPP10E_pFGC5941載體結(jié)構(gòu)示意圖
[0044] 圖 6 為TuVIPP10E_pCAMBIA1300 載體結(jié)構(gòu)示意圖
[0045] 圖7為T1代轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測
[0046] 圖8為T2代轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測
[0047] 圖9為轉(zhuǎn)TuVIPPI擬南芥的表型鑒定
[0048] 圖10為野生型Col-O植株葉綠體結(jié)構(gòu)
[0049] 圖11為純合突變體Atvippl(-/_)葉綠體結(jié)構(gòu)
[0050] 圖12為純合突變背景下的轉(zhuǎn)TuVIPPI植株葉綠體結(jié)構(gòu)
【具體實施方式】
[0051 ] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0052] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0053] 實施例1、TuVIPPI的克隆與測序分析
[0054] 烏拉爾圖小麥（Triticumurartu)品種Gl8I2(Draftgenomeofthewheat A-genomeprogenitorTriticumurartu。Hong-QingLing等，Nature、496 卷、7443 期、頁碼87-90。）的10天幼苗取葉片lOOmg，使用全式金公司EasyPurePlantRNA kit(Code#ER301_01)和TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesis SuperMix(Code#AT311-02)按操作指南提取總RNA，RT-PCR獲得TuVIPPlcDNA全長，具體如 下：
[0055] 1、反轉(zhuǎn)錄
[0056] 以提取的總RNA為模板，按照如下反轉(zhuǎn)錄體系進行，得到cDNA。
[0057] 反轉(zhuǎn)錄體系為：
[0058] TotalRNA 5ul
[0059] 01ig〇-dTIul
[0060] RNase-freeWater 2ul
[0061] 離心管混勻上述溶液，65°C5分鐘，冰浴2分鐘，繼續(xù)加入以下溶液，
[0062] 2XTSReactionMixIOul
[0063] TransScriptRT/RIEnzymeMixIul
[0064] gDNARemoverIul
[0065] 輕輕混勻，置42°C反應(yīng)30分鐘，85°C5分鐘終止反應(yīng)，4°C10分鐘。
[0066] 取Iul反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板進行后續(xù)PCR反應(yīng)。
[0067] 2、PCR擴增TuVIPPI片段
[0068] 克隆TuVIPPI所用引物為：
[0069] TuVIPPl