一種鉻-血紅蛋白螯合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢測(cè)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及一種鉻-血紅蛋白螯合物及其制備方法 和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 血紅蛋白（hemoglobin;HB;HGB)是高等生物體內(nèi)負(fù)責(zé)運(yùn)載氧的一種蛋白質(zhì)。是使 血液呈紅色的蛋白。人類(lèi)紅細(xì)胞內(nèi)有三種正常血紅蛋白即Hb-A、A2&F。Hb-A是正常成人 紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白之主要成分，冊(cè)-六2是次要成分約占2%，而Hb-F在正常成人或兒童之 紅細(xì)胞中占2-3%以下，Hb-F在胚胎十月開(kāi)始產(chǎn)生為胎兒紅細(xì)胞之主要成分，足月新生兒 的紅細(xì)胞中Hb-F占70-80%，其余為Hb-A，二個(gè)月后占50%，四個(gè)月后少于10%，六個(gè)月 后大部消失。血紅蛋白除運(yùn)輸氧氣二氧化碳，還可以導(dǎo)致血管痙攣和血管收縮。在體內(nèi)存 在的三種形式的血紅蛋白，氧合血紅蛋白、還原型血紅蛋白及高鐵血紅蛋白，其中氧合血紅 蛋白縮血管能力最強(qiáng)，而高鐵血紅蛋白幾乎沒(méi)有收縮血管活性。
[0003] 絡(luò)（chromium，Cr)是元素周期表VI族中的一種過(guò)渡金屬，其質(zhì)地堅(jiān)硬，表面具有 光澤，有較高的熔點(diǎn)，在工業(yè)生產(chǎn)中具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，一個(gè)世紀(jì)以來(lái)被廣泛應(yīng)用，每年 全球鉻生產(chǎn)量高達(dá)107噸，因而鉻是一種名副其實(shí)的重要金屬污染物。目前，鉻廣泛應(yīng)用于 電鍍、鞣革、顏料、油漆、合金、印染等各個(gè)方面，與人們的生活息息相關(guān)，但是同樣也對(duì)人 類(lèi)的身體健康產(chǎn)生巨大影響。在美國(guó)，Cr與Cr、Cd、Pb被稱(chēng)為四大環(huán)境污染物。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每 年有幾十個(gè)億的民眾都在飲用鉻污染的水源，而在加利福利亞有高達(dá)30%的水資源都已經(jīng) 被鉻污染，因而鉻污染嚴(yán)重影響著人們的身體健康。
[0004]自然界中鉻主要以三價(jià)和六價(jià)的形式存在，而一般認(rèn)為，三價(jià)鉻（Cr3+)是人類(lèi)所 需的微量元素，而六價(jià)鉻（Cr6+)才是明顯的毒性物質(zhì)。由于六價(jià)鉻易通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞， 而且可以通過(guò)一系列反應(yīng)，產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性及基因毒性，因而普遍認(rèn)為六價(jià)鉻的毒性 高于三價(jià)鉻，達(dá)10-100倍。學(xué)者認(rèn)為當(dāng)水中的六價(jià)鉻含量超過(guò)〇.〇5mg/L即是有毒的。六 價(jià)鉻可以通過(guò)皮膚接觸、食物攝入、飲用水飲入、呼吸道吸入等途徑進(jìn)入人體，對(duì)于職業(yè)性 暴露人群主要是通過(guò)呼吸道吸入六價(jià)鉻灰塵，而對(duì)于普通人群則是通過(guò)飲入污染水源、食 入被污染的食物、吸入等方式攝入六價(jià)鉻。六價(jià)鉻進(jìn)入體內(nèi)后，可以引發(fā)氧化應(yīng)激、染色體 畸變、細(xì)胞凋亡、多種DNA損傷（包括單鏈斷裂、DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)、DNA-氨基酸交聯(lián)、Cr-DNA 配合物形成等），從而造成機(jī)體多處組織、器官、系統(tǒng)損傷。不僅如此，六價(jià)鉻還被認(rèn)為是一 種強(qiáng)有力的致癌物，早在1990年國(guó)際癌癥研究組織。
[0005] 鉻與多種蛋白質(zhì)之間關(guān)系密切，可以與多種蛋白質(zhì)結(jié)合，抑制多種蛋白酶的活性。 隨著對(duì)鉻毒性研究的深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到鉻與蛋白的相互作用在其致毒過(guò)程中扮演著重 要的角色，被認(rèn)為是了解鉻的毒性機(jī)理的關(guān)鍵所在，因此，對(duì)鉻和蛋白質(zhì)相互作用的研究就 顯得愈發(fā)重要。而現(xiàn)在關(guān)于鉻與蛋白質(zhì)作用的機(jī)理僅是冰山一角，還有很多蛋白質(zhì)與鉻之 間的關(guān)系還不清楚，因而加強(qiáng)對(duì)于鉻與蛋白質(zhì)之間的關(guān)系至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)鉻污染嚴(yán)重的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種鉻-血紅蛋白螯合物及其制 備方法，并建立鉻-血紅蛋白螯合物的定性、定量檢測(cè)方法，以便定量檢測(cè)鉻-血紅蛋白螯 合物在評(píng)價(jià)一個(gè)地區(qū)鉻污染程度的應(yīng)用。通過(guò)定量檢測(cè)一個(gè)地區(qū)人群血清中鉻-血紅蛋白 螯合物可以間接反映這個(gè)地區(qū)人群受鉻污染的情況，從而間接反映這個(gè)地區(qū)鉻污染程度。
[0007] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：提供一種鉻-血紅蛋白螯合物，鉻 離子與血紅蛋白通過(guò)巰基或/和半胱氨酸殘基螯合而成。
[0008] 本發(fā)明還提供一種上述的鉻_血紅蛋白螯合物的制備方法，包括以下步驟：
[0009] A)鉻與血紅蛋白的螯合反應(yīng)：在提純?cè)从谌梭w的血紅蛋白或按照生物學(xué)方法重 組的血紅蛋白中加入鉻離子進(jìn)行螯合反應(yīng)，得到反應(yīng)溶液；
[0010] B)純化鉻_血紅蛋白螯合物的提?。翰捎妹庖哂H和層析法，去除反應(yīng)溶液中未反 應(yīng)的血紅蛋白以及多余的鉻離子，即得鉻-血紅蛋白螯合物。
[0011] 其中，體外合成法中所述步驟B)具體如下：
[0012] (1)溶解樣品：向經(jīng)過(guò)步驟A)得到的反應(yīng)溶液中加入生理鹽水使鉻-血紅蛋白螯 合物復(fù)溶；
[0013] (2)平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與血紅 蛋白特異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0014] (3)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)中樣品，然后上柱，血紅蛋 白與填料特異性結(jié)合；
[0015] (4)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線(xiàn)平衡，然后使用0. 05-0.lmol/L的磷 酸鹽溶液進(jìn)行洗脫，得到洗脫液I;
[0016] (5)收集：收集洗脫液I;
[0017] (6)透析：將步驟（5)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三次 后，4°C透析過(guò)夜，收集樣本；
[0018] (7)平衡層析柱：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與鉻特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0019] (8)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟(6)中樣本，然后上柱；
[0020] (9)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線(xiàn)平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的磷 酸鹽溶液進(jìn)行洗脫，得到洗脫液II;
[0021] (10)收集：收集洗脫液II;
[0022] (11)透析：將步驟（10)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三 次后，4 °C透析過(guò)夜，收集樣本，即得鉻-血紅蛋白螯合物。
[0023] 其中，上述鉻-血紅蛋白螯合物的制備方法，還包括步驟C):對(duì)鉻-血紅蛋白螯合 物的鑒定；
[0024] 其中，步驟C)中具體如下：
[0025] (1)制備膠床：以瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床；
[0026] (2)加樣：取步驟B)中提取純化得到的鉻-血紅蛋白螯合物，加入稀釋緩沖液，并 混勻，然后加樣于樣品槽中；
[0027] (3)電泳：連接電泳板，進(jìn)行電泳；
[0028] (4)檢測(cè)：在膠床上找出含鉻的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法檢測(cè)是否含有鉻以及檢測(cè)鉻的含量。
[0029] 本發(fā)明還提供一種如上述的鉻-血紅蛋白螯合物在制備檢測(cè)人體內(nèi)鉻-血紅蛋白 螯合物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0030] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的鉻-血紅蛋白螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品的試劑盒。
[0031] 優(yōu)選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液含有捕獲血紅蛋白的物質(zhì)或捕獲鉻 的物質(zhì)。
[0032] 本發(fā)明還提供一種定量檢測(cè)鉻-血紅蛋白螯合物的方法，以已知含量的上述的 鉻-血紅蛋白螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用以下方法之一對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)：酶聯(lián)免疫法、酶聯(lián)免 疫與原子吸收光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純鉻-血紅蛋白 螯合物與酶聯(lián)免疫結(jié)合法、提純鉻-血紅蛋白螯合物與原子吸收光譜結(jié)合法、提純鉻-血紅 蛋白螯合物與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原子吸收光譜或電感耦合 等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
[0033] 實(shí)施本發(fā)明的鉻-血紅蛋白螯合物及其制備方法和應(yīng)用，具有以下有益效果：
[0034] 1.本發(fā)明首次體外合成鉻-血紅蛋白螯合物；
[0035] 2.本發(fā)明首次提出鉻-血紅蛋白螯合物可用于制備檢測(cè)血樣中鉻-血紅蛋白螯合 物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0036] 3.本發(fā)明建立了鉻-血紅蛋白螯合物的定性定量檢測(cè)方法，以便定量檢測(cè)鉻-血 紅蛋白螯合物在評(píng)價(jià)一個(gè)地區(qū)鉻污染程度的應(yīng)用。通過(guò)定量檢測(cè)一個(gè)地區(qū)人群血清中 鉻-血紅蛋白螯合物可以間接反映這個(gè)地區(qū)人群受鉻污染的情況，從而間接反映這個(gè)地區(qū) 鉻污染程度。本發(fā)明建立的鉻-血紅蛋白螯合物定量檢測(cè)方法其準(zhǔn)確度大大提高，并且使 檢測(cè)的重復(fù)性得到大大提高。
【附圖說(shuō)明】
[0037] 圖1為本發(fā)明所述的鉻-血紅蛋白螯合物的非變性電泳條帶圖；
[0038] 圖2為本發(fā)明所述的鉻-血紅蛋白螯合物的電泳條帶的同步輻射X線(xiàn)熒光分析 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 下面，結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
[0040] 本發(fā)明除特別說(shuō)明外，涉及的實(shí)驗(yàn)操作步驟均為本領(lǐng)域常規(guī)的步驟，所用試劑、材 料如下述所列舉，在本發(fā)明中沒(méi)有列舉出來(lái)的均為本領(lǐng)域常用的試劑或可以通過(guò)市購(gòu)方式 獲得：
[0041] 磷酸鹽溶液為 0? 05-0.lmol/LNa2HPO4溶液或 0? 5-lmol/LNa2HP04溶液；
[0042] 提取試劑為PEG溶液、硼酸鹽緩沖液等（采用PEG法）；
[0043] 膠床介質(zhì)為瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種；
[0044] 捕獲血紅蛋白的物質(zhì)為上海江萊生物科技有限公司生產(chǎn)的型號(hào)為KAY0043的抗 血紅蛋白抗體；其中，本發(fā)明所述與血紅蛋白特異性結(jié)合的物質(zhì)、抗HB抗體、抗血紅蛋白抗 體均為捕獲血紅蛋白的物質(zhì)；
[0045] 捕獲鉻的物質(zhì)（抗鉻抗體）購(gòu)買(mǎi)自廣州然科生物科技有限公司的型號(hào)為RK10641 的抗鉻抗體；其中，本發(fā)明所述與鉻特異性結(jié)合的物質(zhì)、抗Cr抗體、抗鉻抗體、鉻抗均為捕 獲鉻的物質(zhì)；
[0046] 酶標(biāo)抗體為含有辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶等酶標(biāo)記的抗體中的一種；
[0047] 底物為甲基聯(lián)苯胺（TMB)溶液；
[0048] 紅細(xì)胞裂解液的配方如下：139. 6mmol/LNH4Cl, 16. 96mmol/LTris，用lmol/LHCl 調(diào)pH至7. 2 ;
[0049] 洗滌液為含有KH2PO4O. 2mg/ml、Na2HPO4 ? 12H20 2. 90mg/ml、NaCl8.Omg/ml、KCl 0? 2mg/ml、0. 5%Tween-20 的pH為 7. 4 的 0? 15MPBS溶液；
[0050] 封閉液為I% -5 %牛血清白蛋白或脫脂奶粉；
[0051] 稀釋緩沖液為含I. 5mg/mLNa2C03、2. 93mg/mlNaHCO3的P