一種地西泮lipocalin模擬抗體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種地西泮模擬抗體。屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，該模擬抗體可以用于研制 快速檢測地西泮殘留的免疫檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 地西泮（Diazepam,DZP)，別名安定或苯甲二氮卓，化學(xué)名7-氯-1,3-二氫-1-甲 基-5-苯基-2H-1，4-苯并二氮卓-2-酮，分子式C16H13ClN2O,分子量284. 76。它屬于長效 苯二氮卓類抗焦慮藥，有抗焦慮、鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥、抗癲癇、松弛骨骼肌肉及消除記憶等 作用。廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)，長期服用有成癮性和依賴性。地西泮是國家違禁品，只作為處 方藥售出，具有鎮(zhèn)靜、催眠作用，犯罪分子常利用DZP的這一特點實施犯罪，造成很大社會 危害。而且投毒、誤服大量DZP而中毒事件也時有發(fā)生。因此，建立快速、靈敏的DZP檢測 方法是打擊此類犯罪活動、控制DZP濫用的一種重要手段。
[0003]DZP的檢測方法多集中在臨床醫(yī)學(xué)、刑偵檢測方面，如血液、尿液、胃內(nèi)溶物、肝中 地西泮的檢測。常用的檢測方法有：儀器方法，包括高效液相色譜法（HPLC)，薄層掃描法 (TLC)，光化學(xué)熒光分析法（PCFA)，差示分光光度法。每種檢測方法也有自己的不足之處。 大型儀器檢測方法靈敏度較高，可以解決部分實際問題。但其樣品前處理繁瑣、儀器昂貴、 檢測成本高、需專業(yè)技術(shù)人員操作，且操作費時，分析效率低，技術(shù)普及困難，且大多數(shù)用于 法醫(yī)上對中毒癥狀的鑒定，不適合可食動物組織中地西泮殘留的檢測，也不適用于現(xiàn)場快 速大量檢測。
[0004] 核糖體展示技術(shù)（ribosomedisplay,RD)是一種簡便有效的新型體外篩選和分子 進化功能性蛋白質(zhì)的生物文庫技術(shù)，它將可擴增的基因組信息DNA或RNA與可選擇的蛋白 質(zhì)聯(lián)系在一起。RD技術(shù)中mRNA缺乏終止密碼子并經(jīng)過適當(dāng)修飾，在體外翻譯過程中核糖 體會停留在mRNA的3'末端，mRNA與翻譯產(chǎn)物均不從核糖體上解離下來，形成十分穩(wěn)定的 "mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)"三元復(fù)合物，這種三元復(fù)合體形式將蛋白質(zhì)和mRNA信息連接到一 起，應(yīng)用RD可進行特殊功能的肽和蛋白質(zhì)篩選。Lipocalin是從低等生物(細菌)到高等哺 乳類動物都含有的一組胞外親脂蛋白的總稱，是廣泛存在于自然界功能多樣的小分子蛋白 質(zhì)家族，從低等生物(細菌）到高等哺乳類動物(包括人類）均發(fā)現(xiàn)其蹤跡。Lipocalin是從 膽汁三烯結(jié)合蛋白（BBP)中發(fā)現(xiàn)的，它存在于大菜粉蝶（Pierisbrassicaed)中，它的開口 端是寬而淺的(6-桶結(jié)構(gòu)，較容易和小分子物質(zhì)結(jié)合。目前所報道的Lipocalin文庫都是以 膽汁三烯結(jié)合蛋白為支架改造而來的。盡管脂質(zhì)運載蛋白在不同生物中發(fā)揮著不同的生理 學(xué)功能，但運輸和貯存低溶解度物質(zhì)或化學(xué)敏感性物質(zhì)，如芳香素、維生素、類固醇類激素、 多種二級代謝產(chǎn)物和信息素是它們最典型的生物學(xué)功能。由于脂質(zhì)運載蛋白家族的高級結(jié) 構(gòu)特征與抗體類似，且脂質(zhì)運載蛋白又具備一些抗體所沒有的優(yōu)點，因此，以Lipocalin為 骨架構(gòu)建的突變文庫得到了越來越廣泛的應(yīng)用。經(jīng)過設(shè)計模擬的Lipocalin突變體具有類 似抗體的結(jié)合特異性，因此可以成為模擬抗體。目前，利用核糖體展示技術(shù)篩選小分子抗體 的研究還比較少，針對地西泮模擬抗體的篩選還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是獲得一種地西泮Iipocalin模擬抗體。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0007] -種地西泮Iipocalin模擬抗體，表達所述抗體的DNA序列為序列表中SEQID NO. 1所示的序列。
[0008] 本發(fā)明的優(yōu)點：
[0009] 我們通過多輪生物篩選，獲得了針對地西泮高特異性的地西泮Iipocalin模擬抗 體。為實現(xiàn)對地西泮的快速檢測奠定了基礎(chǔ)。在Iipocalin中，能與祀標分子相互作用的 識別位點在蛋白內(nèi)的包埋率高達95%，而結(jié)合位點在抗體分子內(nèi)的包埋率僅為66%。這是由 于在Iipocalin分子內(nèi)具有能與祀標分子結(jié)合的大的相互接觸面（Ingo, 2003)。Lipocalin 結(jié)構(gòu)簡單，分子量小，有較大的能與靶標分子相結(jié)合的識別位點并且骨架穩(wěn)定，與抗體相比 具有獨特優(yōu)勢。（FlowerDR，1996)。
【附圖說明】
[0010] 圖1為構(gòu)建的核糖體展示模擬抗體文庫的可擴增性鑒定。
[0011] 圖2為模擬抗體文庫中針對靶標小分子地西泮五輪篩選后的鑒定圖。
[0012] 圖3為地西泮模擬抗體陽性克隆子菌落PCR鑒定。
[0013] 圖4為地西泮模擬抗體陽性克隆子的鑒定。
[0014] 圖5為地西泮模擬抗體的表達和純化。
[0015] 圖6為間接競爭ELISA檢測抗體的競爭結(jié)合活性。
【具體實施方式】
[0016] 本發(fā)明提供的地西泮Iipocalin模擬抗體是從核糖體展示Lipocalin模擬抗體庫 中篩選獲得的并進行了可溶性功能表達。
[0017] 實施例1
[0018]Iipocalin模擬抗體文庫的可擴增性鑒定：
[0019] 以Iipocalin家族的一員，膽汁三烯結(jié)合蛋白（BBP)為骨架，隨機引入16個突變 位點，構(gòu)建Iipocalin核糖體展示文庫。以構(gòu)建的Iipocalin文庫為模板，以T7F和TOR為 上下游引物進行PCR擴增，目的條帶大約為900bp。
[0020] 通過上下游引物T7F和RT7從pET32a質(zhì)粒中擴增T7片段如圖I(A)所示，用引 物PDF和PDR擴增Lambda噬菌體的殼蛋白D中的T20-V109序列作為間隔序列（即P片 段），如圖I(B)所示。從圖中可以看出在102bp和300bp處出現(xiàn)目的條帶，與T7片段和P 蛋白基因片段的大小相符，說明擴增成功。通過上游引物FBBP和下游引物Rtail，對已構(gòu)建 的BBP抗體文庫進行擴增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定其結(jié)果.如圖I(C)所示，在558bp大小處 有明亮的條帶，這與構(gòu)建模擬抗體文庫的大小是相當(dāng)?shù)?。因而，?gòu)建的核糖體展示模擬抗體 文庫的可擴增性良好。
[0021] 引物序列：I7F:5,-ATACGAAAITAATACGACTCAC-3，（SEQIDNO. 2)
[0022] PDR:5'-CCGCACACCAGTAAGGTGTGCGGTAACGATGCTGATTGCCGTTCCG-3'（SEQIDNO. 3)
[0023]RT7:5'-CATGGATATATCTCCTTCTTAAAG-3'（SEQIDNO. 4)
[0024] PDF:5'-GGTGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCTA-3'（SEQ ID NO. 5)
[0025]FBBP:5'-GAAGGAGATATATCCATGAACGTGTACCACGACGGTGC-3'（SEQIDNO. 6)
[0026]Rtai1:5，-CGCCAGAGCCACCTCCACCTGAACCGCCTCCACCATTGTTGACTTTGCAGGCG-3，（SEQ IDNO. 7)
[0027] 實施例2
[0028] 地西泮lipocalin模擬抗體的篩選
[0029] 1體外轉(zhuǎn)錄和翻譯
[0030]體外轉(zhuǎn)錄與翻譯米用的是Promega的E. coli S30(Escherichia coli S30Extract System)線性模板系統(tǒng)，它將轉(zhuǎn)錄與翻譯偶聯(lián)在一起。
[0031] 2固相篩選
[0032] (1)包被：酶標板經(jīng)DEPC水浸泡烘干后，取偶聯(lián)后的完全抗原DZP-0VA/DZP-BSA， 用碳酸鹽緩沖液稀釋至10Pg/mL，每孔中加入200iiL，4°C條件下孵育8h。
[0033] (2)第二天，傾去包被液，用滅菌后的PBS洗滌包被孔3次，每次3min;然