一種高得率高巖藻糖比例的巖藻多糖的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種高得率高巖藻糖比例的巖藻多糖的提取方法，屬于海藻加工利用
技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國(guó)藻類資源豐富，尤以褐藻資源突出，是海藻生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)。褐藻中含有豐富 的多糖成分，如褐藻膠，海帶多糖，卡拉膠等，均已成為重要的食品或醫(yī)藥原料并被廣泛應(yīng) 用。在我國(guó)、日本沖繩、沿海均有分布。
[0003] 巖藻多糖（Fucoidan)，是褐藻中所固有的細(xì)胞間多糖，存在于細(xì)胞壁基質(zhì)中。近 代研究表明，巖藻多糖具有抗凝血、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、促進(jìn)肌膚再生、皮膚保濕等超 過(guò)20項(xiàng)的生理功效，低分子量巖藻多糖尤其以抗腫瘤功效最為突出。與靈芝多糖、姜黃素 等相比，巖藻多糖不僅能夠增強(qiáng)人體免疫力，而且具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的特殊功效，在功 能性食品和藥品行業(yè)具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?br>[0004]巖藻多糖主要成分是L-巖藻糖，線性主鏈一般是巖藻糖以a_l，3或a_l，4糖苷 鍵連接而成同時(shí)伴有半乳糖，甘露糖，葡萄糖，木糖等單糖組分的硫酸化雜多糖。吳興中等 研究發(fā)現(xiàn)巖藻糖鏈在肝癌細(xì)胞迀移中可起到抑制作用，外源性的加入巖藻糖糖鏈時(shí)，癌細(xì) 胞迀移抑制呈濃度依賴性，由此可知，該多糖中巖藻糖的含量與巖藻多糖的生物學(xué)活性具 有相關(guān)聯(lián)系。一般以褐藻為來(lái)源的巖藻多糖的巖藻糖含量在10-50%。硫酸多糖中硫酸根 的含量是決定其活性大小的極為重要的指標(biāo)，同時(shí)也是研究構(gòu)效關(guān)系的重要方面。對(duì)來(lái)源 于褐藻的天然硫酸多糖巖藻多糖，硫酸根的存在對(duì)其物理化學(xué)性質(zhì)及生物活性同樣具有重 要影響，因此硫酸根的含量是鑒定巖藻多糖樣品及分析構(gòu)效關(guān)系的重要參數(shù)。巖藻多糖的 傳統(tǒng)提取方法中以水提法和酸提法最為常見(jiàn)，然而米取傳統(tǒng)的提取發(fā)法所得的巖澡多糖雜 質(zhì)多，得率低，品質(zhì)低。當(dāng)今市場(chǎng)所出售的巖藻多糖品質(zhì)不高，含有部分褐藻膠成分，質(zhì)量不 足以用于保健品行業(yè)，故尋求"高附加值，高效率，低成本"的海藻加工技術(shù)已成為新的發(fā)展 方向。由于原巖藻多糖分子質(zhì)量大、溶解性差，不容易被吸收，嚴(yán)重限制了其應(yīng)用，但經(jīng)過(guò)部 分降解的低分子質(zhì)量巖藻多糖，生物活性更加顯著，研究表明，分子量8000-30000的巖藻 多糖抗腫瘤活性較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種高得率高巖藻糖比例的巖藻多糖的提取方 法，是從海蘊(yùn)中制備抗腫瘤巖藻多糖的的方法，該方法可高效制備出環(huán)保、無(wú)污染、高純度 的巖藻多糖產(chǎn)品。
[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種高得率高巖藻糖比例的巖藻多糖的提取方法，所述方法 包括：以海蘊(yùn)為原料，經(jīng)高壓均質(zhì)、離心取上清、乙醇沉糖、過(guò)濾、干燥，得巖藻多糖。
[0007] 所述高壓均質(zhì)，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是在10_20Mpa下，按料水比 1:30-1:160,均質(zhì)1-3次。
[0008] 所述料水比，在本發(fā)明是指海蘊(yùn)的干重與水的質(zhì)量比。
[0009] 所述海蘊(yùn)，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是干海蘊(yùn)（濕度可以是8-10%)或者新鮮 海蘊(yùn)。當(dāng)使用干海蘊(yùn)作為原料時(shí)，先加水泡一泡，吸水溶脹后再進(jìn)行高壓均質(zhì)。
[0010] 所述乙醇沉糖，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是使用體積分?jǐn)?shù)為70-80 %的乙醇。
[0011] 所述乙醇沉糖，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是取離心后的上清液，即提取液，加 入3-4倍體積的無(wú)水乙醇，混勻、靜置，得沉淀物。
[0012] 所述離心，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是在4000-5000rpm下離心10-15min。
[0013] 所述過(guò)濾，在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，是采用離心或者板框過(guò)濾。
[0014] 所述干燥，在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，為真空干燥。
[0015] 所述方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，離心取上清與乙醇沉糖步驟之間，還包括 化學(xué)降解或者酶法降解、超濾，以獲得相應(yīng)分子量范圍的巖藻多糖。
[0016] 所述方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，包括：（1)高壓均質(zhì)：取海蘊(yùn)，按料水比 1:30-1:160加入水，然后在10-20Mpa下均質(zhì)1-3次；(2)離心取上清：將高壓均質(zhì)后的物 料進(jìn)行離心，取上清液，即為提取液；（3)化學(xué)降解：濃縮提取液至原體積的1/4-1/2,然后 加入30%的H2O2,，50-60°C水浴，降解l_4h，調(diào)節(jié)降解液pH至中性，然后加過(guò)氧化氫酶反應(yīng) 10-20min;(4)超濾：降解液流經(jīng)不同截留分子量的超濾柱，得截留液；(5)乙醇沉糖：在上 一步得到的截留液中加入3-4倍體積的無(wú)水乙醇，混勻，靜置；(6)沉淀物經(jīng)過(guò)濾、干燥，即 得巖藻多糖。
[0017] 所述步驟（3)，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，30%H2O2的添加量為每L中添加 5_8mL〇
[0018]所述步驟（3)，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，過(guò)氧化氫酶酶活為1萬(wàn)-5萬(wàn)U/mL，添 加量 0. 1-0. 4mL/L。
[0019]所述步驟（3)，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是采用截留分子量為30KD、IOKD的超 濾柱，從而得到分子量在10000-30000之間的巖藻多糖。
[0020] 所述步驟（3)，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是采用減壓濃縮，條件為溫度 70-75°C，真空度為-0?IMPa。
[0021] 所述方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，包括：（1)高壓均質(zhì)：取海蘊(yùn)，按料水比 1:30-1:160加入水，然后在10-20Mpa下均質(zhì)1-3次；（2)離心取上清：將高壓均質(zhì)后的物料 進(jìn)行離心，取上清液，即為提取液；（3)酶法降解：濃縮提取液，加檸檬酸-檸檬酸鈉調(diào)pH至 5-6,按照每L濃縮提取液添加50-55U的巖藻多糖酶，降解2-5h，降解液過(guò)超濾柱，得截留 液；（5)乙醇沉糖：在上一步得到的截留液中加3-4倍體積的無(wú)水乙醇，混勾，靜置；(6)沉 淀物經(jīng)過(guò)濾、干燥，即得巖藻多糖。
[0022] 所述巖藻多糖酶，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，提取自黑曲霉。
[0023]所述巖藻多糖酶，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是通過(guò)以下方式得到的：將黑曲霉 進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液離心后的上清液為粗酶液1，菌體經(jīng)復(fù)溶、超聲破碎、冷凍離心 后的上清為粗酶液2 ;取粗酶液，4°C加入硫酸銨固體至飽和度為80 %，攪拌2h，靜置過(guò)夜， 10000rpm/min，冷凍離心 20min，收集沉淀，T-buffer溶解，10000rpm/min，冷凍離心 20min 后取上清，并在4°C下透析24h，濃縮，過(guò)DEAE-sepharoseFF陰離子交換柱，T-buffer平衡， 用0-2MNaCl梯度洗脫，收集洗脫峰，合并組分，濃縮，在4°C下透析24h，濃縮，過(guò)凝膠色譜 柱sphacryl S-300,磷酸緩沖液平衡，洗脫收集活性組分，濃縮，凍干得純酶。
[0024] 所述巖藻多糖酶，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，其酶活測(cè)定方法為：將待測(cè)酶液加 到〇.5%巖藻多糖溶液（用緩沖液配制），在50°(：，反應(yīng)111。沸水浴滅酶15 1^11，用0吧法 測(cè)定還原糖含量，空白為將待測(cè)酶液于沸水浴15min后，再進(jìn)行上述操作；酶活單位定義為 50°C、pH值6. 0條件下每小時(shí)釋放Iymol巖藻糖需要的酶量。
[0025] 所述方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，高壓均質(zhì)步驟后緊接水提步驟；所述水提 是在超聲或者攪拌條件下進(jìn)行。
[0026] 所述水提，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是將高壓均質(zhì)后的物料，在超聲或者攪拌 條件下提取l_6h，然后再進(jìn)行下一步的離心操作。
[0027] 所述水提，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是在50_60°C水浴下進(jìn)行。
[0028] 所述水提，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是反復(fù)提取2-3次，提取液合并。
[0029] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：
[0030] 1.本發(fā)明采用海蘊(yùn)為原材料，采用高壓勻漿的方法提取巖藻多糖，提取時(shí)間短，提 取效率高，而且最大程度的保留了巖藻多糖天然組分的含量。
[0031] 2.本發(fā)明利用高壓勻漿，與化學(xué)降解法或酶法降解法相結(jié)合降解巖藻多糖，通過(guò) 超濾技術(shù)，最終獲得抗腫瘤活性明顯的中低分子量的巖藻多糖。
[0032] 3.本發(fā)明提取條件溫和，不用酸堿類，最大限度的保證了巖藻多糖的生物活性，而 且提取過(guò)程中無(wú)酸堿類廢液的排放，有利于環(huán)保。
[0033] 4.本發(fā)明制得的巖藻多糖的得率在21%-35%，純度85%-90%，其中巖藻糖含量 達(dá)70 % -75 %，有機(jī)硫酸跟含量達(dá)20 % -23 %，分子量10000-30000，達(dá)到市場(chǎng)一級(jí)以及優(yōu)級(jí) 品標(biāo)準(zhǔn)。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 巖藻多糖測(cè)定：采用苯酚硫酸法測(cè)多糖，以巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)做標(biāo)準(zhǔn)曲線；以巖藻糖濃 度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y= 0. 0135x+0. 0066,R2= 0.9991。
[0035]巖藻多糖的單糖組分分析：離子色譜-脈沖安培法（IC-PAD)，色譜柱為CarboPac PA20 ;流動(dòng)相：H20,250mmol/LNa0H，lmol/L NaAc ;流速：0.