原子轉(zhuǎn)移自由基聚合制備高容量蛋白質(zhì)層析介質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于原子轉(zhuǎn)移自由基聚合制備高容量蛋白質(zhì)離子交換層析介質(zhì) 的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)離子交換層析是基因工程蛋白質(zhì)藥物生產(chǎn)的核心技術(shù)。作為該技術(shù)的基 礎(chǔ)的離子交換層析介質(zhì)則在過去的二、三十年間嚴重滯后于基因工程蛋白質(zhì)表達水平和生 產(chǎn)能力。例如，迄今常規(guī)離子交換層析介質(zhì)中牛血清白蛋白的結(jié)合容量僅為70mg/mL甚至 更低。因此，提高蛋白質(zhì)結(jié)合容量（bindingcapacity)已經(jīng)成為了當前實現(xiàn)蛋白質(zhì)離子交 換層析過程高效化的重要前提之一。在離子交換層析中，蛋白質(zhì)的結(jié)合容量取決于層析介 質(zhì)的蛋白質(zhì)飽和吸附容量和層析介質(zhì)內(nèi)的傳質(zhì)速率。目前，多糖、硅膠、金屬氧化物等常用 的蛋白質(zhì)離子交換層析介質(zhì)材料中孔道尺寸在IOOnm左右。這些介質(zhì)在具備較高比表面積 提高蛋白質(zhì)的飽和吸附容量的同時，蛋白質(zhì)分子（1~30nm)在孔道內(nèi)的傳質(zhì)阻力也顯著 惡化。為了改善這一情況，Afeyan等人率先報道了具有微米級孔道結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)層析材料 【Journalofchromatographyl990, 519(1) : 1-29】，在介質(zhì)內(nèi)部引入對流強化介質(zhì)內(nèi)傳質(zhì) 速率。此后，多種具有類似孔道結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)層析介質(zhì)及其制備方法被先后公開【Advances inBiochemicalEngineering-Biotechnology2009,113:217-254】。例如，中國發(fā)明專利 ZL03130027. 8公開了一種高容量大孔瓊脂糖凝膠介質(zhì)的制備方法，以碳酸鈣顆粒為致孔劑 利用油水兩相法合成具有微米級超大孔的瓊脂糖介質(zhì)，該介質(zhì)的傳質(zhì)速率和動態(tài)吸附容量 等都有明顯的提高。但這類層析材料性能的提高是以犧牲部分飽和吸附容量為代價的。上 世紀90年代，安瑪西亞公司（GEHealthcare的前身）推出了葡聚糖接枝的瓊脂糖凝膠離子 交換層析介質(zhì)SepharoseXL。Bowes等人報道，SepharoseXL對單克隆抗體的飽和吸附容 量達到 330mg/mL【JournalofChromatographyA, 2009, 1216:7774-7784】。余林玲等人進 一步發(fā)現(xiàn)，聚乙烯亞胺接枝的瓊脂糖離子交換層析介質(zhì)具有臨界的離子交換容量【Journal ofChromatographyA2013,1305:76-84】。在臨界離子交換容量以上，聚乙稀亞胺接枝的 瓊脂糖離子交換層析介質(zhì)的飽和吸附容量和傳質(zhì)速率出現(xiàn)跳躍式提高。但葡聚糖、聚乙烯 亞胺等聚合物存在較寬的分子量分布，聚合物溶液黏度高、聚合物接枝反應(yīng)屬典型的多點 接枝，因此接枝過程難以控制，產(chǎn)品性質(zhì)不穩(wěn)定。
[0003] 針對上述的缺陷，Unsal等人率先報道了采用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（ATRP)方法制 備蛋白質(zhì)層析介質(zhì)的方法【AnalyticalChemistry2006,78(16) :5868-5875】。該方法的特 征在于，以 3-(2-Bromoisobutyramido)propyl(triethoxy)silane(BIBAPTES)為引發(fā)劑在 平均孔徑50nm的甲基丙稀酸二羥基丙酯（dihydroxypropylmethacrylate)與二甲基丙稀 酸乙酯（ethylenedimethacrylate)共聚微球上接枝單體化合物磺丙基甲基丙稀酸3-磺 酸丙酯合成聚合物接枝離子交換層析介質(zhì)。合成的離子交換層析介質(zhì)在較寬聚合度范圍 (2. 2 - 25. 1)內(nèi)具備穩(wěn)定的蛋白質(zhì)分離作用，但未見對蛋白質(zhì)飽和吸附容量的改善。中國發(fā) 明專利201410142858. 1公開了通過ATRP技術(shù)在超大孔聚苯乙烯微球表面接枝溫敏聚合物 刷制備聚合物接枝蛋白質(zhì)分離介質(zhì)的方法，其優(yōu)勢在于利用該介質(zhì)分離蛋白質(zhì)的過程中很 好地維持了蛋白質(zhì)活性，但蛋白質(zhì)飽和吸附容量僅為每克干球37.lmg。美國GEHealthcare 公司公開了一種利用ATRP技術(shù)合成聚合物整體柱的方法【USPatent，US2009/0095668 A1】。該方法的特征在于，整體柱的合成在相對溫和環(huán)境中進行，經(jīng)表面改性獲得的吸附材 料可用于分離細胞、質(zhì)粒DNA和蛋白質(zhì)等生物大分子。
[0004] 蛋白質(zhì)在層析介質(zhì)上的飽和吸附容量是提高離子交換層析介質(zhì)性能的基石，其核 心在于為層析介質(zhì)提供盡可能多的有效結(jié)合位點?；谏鲜龅乃悸?，本發(fā)明利用ATRP技術(shù) 在聚甲基丙烯酸縮水甘油酯微球粒子表面接枝單體化合物合成用于具有較高蛋白質(zhì)飽和 吸附容量的離子交換層析介質(zhì)。這種離子交換層析介質(zhì)具有蛋白質(zhì)吸附容量高、聚合物鏈 長和密度可控、產(chǎn)品性能穩(wěn)定等特點，在蛋白質(zhì)的分離方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種基于原子轉(zhuǎn)移自由基聚合制備高容量蛋白質(zhì)離子交 換層析介質(zhì)的方法，所述聚合物接枝離子交換層析介質(zhì)具有吸附容量大、制備工藝簡單、接 枝的聚合物鏈密度和長度可控、條件溫和、價格低廉等特點。
[0006] 本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案加以實現(xiàn)的：
[0007] -種原子轉(zhuǎn)移自由基聚合制備高容量蛋白質(zhì)層析介質(zhì)的方法；其特征在于：
[0008] 1)在聚甲基丙烯酸縮水甘油酯微球上偶聯(lián)引發(fā)劑2-溴異丁酰溴的微球的溴化過 程；
[0009] 2)通過自由基轉(zhuǎn)移引發(fā)單體化合物在微球表面聚合反應(yīng)，得到層析介質(zhì)的離子交 換聚合物接枝層析介質(zhì)的合成過程。
[0010] 所述的單體化合物是一端含季銨基團和另一末端為丙烯?；蚣谆┧峄?化合物分子。
[0011] 所述的單體化合物優(yōu)選自甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨、丙烯酰氧乙基三甲基 氯化銨、甲基丙烯酰胺丙基三甲基氯化銨、甲基丙烯酰胺乙基三甲基氯化銨或丙烯酰胺乙 基三甲基氯化銨一種。
[0012] 所述的溴化過程為：聚甲基丙烯酸縮水甘油酯微球加入到含三乙胺的正己烷溶液 中，混合溶液置于冰水浴中冷卻后滴加含2-溴異丁酰溴的正己烷溶液，冰浴反應(yīng)0. 5 - 3. 0 小時后轉(zhuǎn)移至室溫下繼續(xù)反應(yīng)3 - 36h，得到溴含量為10-150. 6ymol/g干燥微球的溴化微 球；反應(yīng)得到的溴化微球經(jīng)用正己烷、無水乙醇和去離子水依次清洗后收集。
[0013] 優(yōu)選正己燒的體積用量為5_15mL/g微球，三乙胺的體積用量為0.12-I. 2mL/g微 球，2-溴異丁酰溴體積用量為0.I-I.OmL/g微球。
[0014] 所述的合成過程為：溴化微球懸浮于異丙醇-水的混合溶液后，向其中加入單體 化合物；混勻后的懸浮液在氮氣保護下加入由溴化亞銅、溴化銅以及配體化合物2, 2'-聯(lián) 吡啶構(gòu)成的催化劑；反應(yīng)體系中，異丙醇-水混合溶液體積用量為3-30mL/g微球，其中異 丙醇和水的體積比為1:10 _ 2:1 ;單體化合物加入量為I. 0-50.Ommol/g微球。
[0015] 所述的溴化亞銅、溴化銅、聯(lián)吡啶與單體化合物的摩爾比為1:0. 1:2:100。
[0016] 所述的反應(yīng)物在室溫無氧條件下反應(yīng)0. 5 - 24h ;反應(yīng)產(chǎn)物用異丙醇、無水乙醇和 去離子水依次清洗，得到用于蛋白質(zhì)分離純化的聚合物接枝離子交換層析介質(zhì)。
[0017] 上述微球溴化過程，優(yōu)選的三乙胺的體積用量為0. 20-0. 60mL/g微球，優(yōu)選的 2_溴異丁酰溴體積用量為0. 20-0. 50mL/g微球；上述微球聚合過程，優(yōu)選的單體化合物加 入量為5. 4 - 32. Ommol/g微球。
[0018]與傳統(tǒng)離子交換層析介質(zhì)和其他聚合物接枝離子交換層析介質(zhì)相比，本發(fā)明提供 了用于蛋白質(zhì)分離純化的聚合物接枝離子交換層析介質(zhì)及其制備方法具有如下顯著的特 點：（1)本發(fā)明涉及一種通過ATRP技術(shù)制備聚合物接枝離子交換層析介質(zhì)的方法，該方法 合成的聚合物接枝層析介質(zhì)具有接枝聚合物密度和鏈長可控、反應(yīng)條件溫和、作為單體的 單體化合物選擇余地大等