一種不含外源dna片段的氧化葡萄糖酸桿菌基因工程菌及其制備方法和應(yīng)用【
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】[0001]本發(fā)明設(shè)及一種不含外源DNA片段的氧化葡萄糖酸桿菌Gluconobacteroxydans基因工程菌及其應(yīng)用，尤其是生產(chǎn)5-酬基-D-葡萄糖酸巧-keto-D-gluconicacid，5-KGA)的工程菌及應(yīng)用，屬于基因工程及發(fā)酵工程
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背景技術(shù)：
】陽002]氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacteroxydans)621H能耐受高濃度的葡萄糖，并W葡萄糖為底物，不完全氧化為葡萄糖酸（gluconicacid,GA)，進(jìn)一步氧化為2-酬基-D-葡萄糖酸（2-keto-D-gluconicacid,2-KGA)或者5-酬基-D-葡萄糖酸巧-KGA)。是心(+)-酒石酸的重要前體物質(zhì)，早在1933年，Barch就報(bào)道了通過5-KGA化學(xué)催化制備k(+)-酒石酸（JournalofAmericanQiemicalSociety,1933,55,3563),1945年Soltzberg等又申請(qǐng)專利US2380196報(bào)道硝酸氧化5-KGA制備k(+)-酒石酸。然而由于當(dāng)時(shí)5-KGA主要通過葡萄糖脫氨制備，效率不高，因此通過微生物制備并獲得5-KGA具有重要意義。[0003]目前，在微生物制備5-KGA的研究中，主要W德國(guó)化lich研究中屯、為主。借W基因工程手段，對(duì)提高5-KGA產(chǎn)量展開了大量研究，如GA2DH基因（葡萄糖酸-2-脫氨酶(gluconate-2-dehy化ogenase)基因）的失活、GA5DH基因的過表達(dá)、表達(dá)啟動(dòng)子的改造等。據(jù)報(bào)道，其5-KGA的產(chǎn)量最高可達(dá)達(dá)300mM，約58.2g/L(AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2006,73(2),443-451)。近期，日本山口大學(xué)Saichana等篩選到一株耐熱性Gluconobacter，并通過插入抗性基因失活GA2DH，最終5-KGA產(chǎn)量為190mM，約36.86g/L(AppiledandElnviromentalMicrobiology,2009,75(13),4240-4247)。[0004]而國(guó)內(nèi)在生物質(zhì)制備5-KGA研究尚處于起步階段，主要研究重組氧化葡萄糖酸桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)條件，如初糖濃度、接種量、碳氮源等條件。如浙江大學(xué)李博義等研究6.〇巧(1曰]18〔610：1.637在恒定抑5.5，溶氧控制15%的條件下，流加補(bǔ)葡萄糖，最終5-KGA產(chǎn)量達(dá)到75.5g/l，轉(zhuǎn)化率超過70%(生物工程學(xué)報(bào)，2014,30巧)，1486-1490);天津科技大學(xué)譚之磊等W2-KGA缺陷型的GluconobacteroxydansHGI-1為出發(fā)菌株考察碳氮源對(duì)5-KGA合成的影響，化發(fā)酵罐中進(jìn)行分批發(fā)酵放大試驗(yàn)，5-KGA的產(chǎn)量為93.80g/l，平均生成速率為1.56g/L?h(生物工程學(xué)報(bào)，2014,30(1)，76-82)。陽0化]對(duì)工業(yè)應(yīng)用的微生物進(jìn)行基因修飾（geneticmodification,GM)是提升其應(yīng)用潛力的有效手段，W上對(duì)5-KGA產(chǎn)量的研究主要針對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行修飾。而基因修飾的安全性最重要的方面包括基因的穩(wěn)定性和表現(xiàn)型的可預(yù)測(cè)性。因此，應(yīng)該盡量減少或避免生物中所含轉(zhuǎn)基因的數(shù)量和轉(zhuǎn)基因的表達(dá)產(chǎn)物，主要包括：（1)激發(fā)外源DNA與其他基因組發(fā)生融合的轉(zhuǎn)座子；（2)抗生素抗性基因。[0006]然而如何保證工程菌及其產(chǎn)物的安全性是構(gòu)建GM微生物首先要考慮的問題。自2001年1月18日，抑A發(fā)布了"關(guān)于生物工程食品進(jìn)入市場(chǎng)前的通告"（PremarketNoticeConcerningBioengineeredfloods,抑A,2001a)，對(duì)建立GM生物的安全性提出了一系列建議。FDA的法規(guī)21C.F.R.§170.36(見62化d.Reg.18,938(April17,1997))、歐盟巧C)N〇1830/2003法規(guī)W及犯CD:Safetyevaluationoffoodsderivedbymodernbiotechnology,conceptsandprinciples中明確限定了GM生物及其產(chǎn)物的適用范圍，僅少數(shù)米曲霉（Aspergillusoryzae)、里氏木霉（Trichodermareesei)、米根霉（Miizopusoryzae)、黑曲霉（Aspergillusniger)及枯草芽抱桿菌度acillussubtilis)等GM微生物，其生產(chǎn)的相關(guān)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物可W在食品中應(yīng)用。另外，W上法規(guī)中還?？谝?guī)定了一種自克隆微生物（Self-cloningorganism)在食品加工過程中的應(yīng)用。典型就是葡萄酒酵母(wineyeast),其也是最早商業(yè)化在食品加工中使用的GM微生物（GMWineSold化1油elledintheUnitedStates,thisseries)。在2006年，美國(guó)FDA指定了另一種葡萄酒酵母ECM001為GRAS微生物。其來源于啤酒酵母（SaccharomycescerevisiaeDavis522)，攜帶有另外一株S.cerevisiae的DURl,2基因、一個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)終止子（GRN000175：http：//WWW.fda.Rov/ucm/Rroups/fdaRov-public/ifdaRov-foods-Ren/documents/document/ucm268877.p壯)，通過表達(dá)尿素氨基水解酶來降低釀酒過程中的尿素。[0007]目前，在日本也同樣支持自克隆GM在食品中應(yīng)用。在Sake(-種米酒）釀造過程中，通過基因組修飾，在不含外源DNA片段的前提下，表達(dá)Saccharomycescerevisiae的乙酷基轉(zhuǎn)移酶（acety]_-transferase)和乙醇己酷轉(zhuǎn)移酶（ethanolhexanoy]_-transferase)來強(qiáng)化芳香物質(zhì)的形成，改善口感（ApplMicrobiolBiotechnol(2004)65:68-73)。因此，在現(xiàn)有國(guó)際法規(guī)下，對(duì)于不含任何外源DM片段的GM微生物及其產(chǎn)物在食品中的應(yīng)用持支持的態(tài)度，也被認(rèn)為是安全的。【
發(fā)明內(nèi)容】[000引本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有5-KGA產(chǎn)量低及基因修飾微生物生物安全性的問題，提供一種生產(chǎn)5-KGA的生物安全的氧化葡萄糖酸桿菌Gluconobacteroxydans基因工程菌及其制備方法和應(yīng)用。[0009]一種不含外源DNA片段的氧化葡萄糖酸桿菌基因工程菌的制備方法，包括如下步驟：[0010](1)將GA2DH基因和PDC基因（丙酬酸脫簇酶（pyruvatedecarboxylase,)基因）的上、下游片段分別引入重組整合型自殺質(zhì)粒pJKM的多克隆位點(diǎn)，分別得到GA2DH基因的自殺型敲除質(zhì)粒PAG0X1231和PDC基因的自殺型敲除質(zhì)粒PAG0X1081;所述重組整合型自殺質(zhì)粒帶有SacB基因、抗生素標(biāo)記和多克隆位點(diǎn)；[0011](2)將所得自殺型敲除質(zhì)粒PAG0X1231電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入宿主菌中，依次經(jīng)抗生素抗性篩選、無抗培養(yǎng)和薦糖篩選，然后通過菌落PCR獲取GA2DH基因敲除的陽性突變子，命名為G.oxydansZJU1;[0012](3)將所得自殺型敲除質(zhì)粒pAGOXlOSl電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入經(jīng)傳代后的G.oxydansZJU1中，依次經(jīng)抗生素抗性篩選、無抗培養(yǎng)和薦糖篩選，然后通過菌落PCR獲取PDC基因敲除的陽性突變子，即得氧化葡萄糖酸桿菌基因工程菌，命名為G.oxydansZJU2。[0013]G.oxydansZJU1經(jīng)過傳代后，自殺質(zhì)粒將自動(dòng)消除，不影響下一步基因的修飾。[0014]所述SacB基因的堿基序列如SEQIDNO.1所示。[0015]優(yōu)選地，所述抗生素標(biāo)記為卡拉霉素抗性基因標(biāo)記。[0016]優(yōu)選地，重組整合型自殺質(zhì)粒pJKM的制備方法如下：[0017](1)構(gòu)建含SacB基因的克隆質(zhì)粒pEASY-Blunt-SacB;[0018]似取測(cè)序正確的克隆質(zhì)粒pEASY-Blunt-SacB，通過SspI單酶切克隆質(zhì)粒pEASY-Blunt-SacB和自殺質(zhì)粒地ISmobGII，回收并連接、轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coliD冊(cè)a，篩選獲取SacB連接方向正確的陽性克隆，并培養(yǎng)E.coliD冊(cè)a，提取整合型質(zhì)粒，即得所述重組整合型自殺質(zhì)粒pJKM。[0019]本發(fā)明所采用的自殺質(zhì)粒地ISmobGII構(gòu)建方法可參見文獻(xiàn)化Wmobiliz油levectorsuitableforgenereplacementinGram-negativebacteriaandtheiruseinmappingofthe3'endoftheXanthomonascampestrispv.Campestrisgumoperon.ApplEnvironMicrobiol1999,65:278-282,本發(fā)明中由該質(zhì)粒的構(gòu)建者（IELPI，L.InstitutedeInvestigacionesBioqui'micasFundacio'nCampomar,FacultaddeCienciasExactasyNaturales,UBA,andCONICET,1405BuenosAires,Argentina,Phone:54(1)863-4011/19.Fax:54(1)865-2246.E-mail:LIELPI@iib.uba.ar.)提供。從自殺質(zhì)粒地ISmobGII出發(fā)，構(gòu)建新型含有SacB基因的整合型自殺質(zhì)粒pJKM，應(yīng)用于葡萄糖酸桿菌的基因無痕操作。SacB基因編碼一個(gè)可W分泌的果聚糖薦糖酶，其能水解薦糖形成高分子量的果聚糖，使得革蘭氏陰性菌在含有5-10%的薦糖培養(yǎng)基上出現(xiàn)致死表型，W此作為反向篩選標(biāo)記，操作安全，無毒。[0020]構(gòu)建含SacB基因的重組質(zhì)粒祀ASY-Blunt-SacB的方法如下：陽02U(1)W如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的堿基序列為引物擴(kuò)增SacB基因；[0022]上游引物：5,-AATATTcacat當(dāng)前第1頁1 2 3