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      鑒別布魯氏菌s2疫苗株與野毒株的試劑盒的制作方法_2

      文檔序號:9284626閱讀:來源:國知局
      泳儀(北京市六一儀器廠DYY-6C型),A1地a個(gè)人 型凝膠成像系統(tǒng) red(美國 ProteinSimple 公司),DNA 測序儀(ABI3730XL DNA Analyzer)。
      [0046] 實(shí)施例一、鑒別布魯氏菌S2疫苗株與野毒株的PCR試劑盒的使用方法
      [0047] (1)提取待測樣本的基因組DNA:使用快速DNA提取試劑盒對待檢測的血液、奶樣、 組織樣本、氣溶膠等樣本進(jìn)行基因組DNA的提取。
      [0048] (2) W提取的樣本基因組DNA為模板,使用S2-F和S2-R引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 同時(shí)W陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品分別作為陽性和陰性對照,依次將50 y L反應(yīng)體 系的各組份加到PCR反應(yīng)管中,分別為10XPCR Buffer:5.0yLdNTP MixUire(2.5mM): 8.0 y L,10 y M的正向引物:2. 0 y L,10 y M的反向引物:2. 0 y L,待巧U樣本DM:5. 0 y L,DM 聚合酶:0. 5 y L最后加27. 5 y L雙蒸水(dd&O)補(bǔ)足到50 y L。PCR的擴(kuò)增效果直接影響到 檢測結(jié)果的特異性和靈敏性,因此需要對PCR反應(yīng)條件中的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,包括引物 的濃度、Mg 2+濃度、退火溫度、退火時(shí)間、循環(huán)次數(shù)W及延伸時(shí)間等。PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化采 用現(xiàn)有技術(shù),最終優(yōu)化后的PCR反應(yīng)條件為:引物濃度為0. 4ymoL/l,Mg2+濃度為0. 2mmoL/ L,PCR 反應(yīng)條件為:94°C 3min,94°C 30sec、60°C 30sec、72°C 30sec,35 個(gè)循環(huán),72°C lOmin。 W上述優(yōu)化好的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
      [0049] (3)反應(yīng)結(jié)束后,取50^1?〇?產(chǎn)物,^1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳(120¥25111^) 檢測,觀察鑒別豬種布魯氏菌S2疫苗株擴(kuò)增出539bp的條帶。
      [0050] (4)如果上述PCR檢測結(jié)果與目的條帶不符,則說明模板為布魯氏菌陰性,如果 PCR檢測條帶大小正確,則對陽性條帶進(jìn)行切膠回收純化,然后用DNA測序儀進(jìn)行序列測 定。
      [0051] (5)鑒別布魯氏菌S2疫苗株的結(jié)果判定:使用S2-F引物對純化的539bp產(chǎn)物進(jìn) 行測序,如果測序結(jié)果峰圖為單一峰,與SEQ ID No. 3比對后完全匹配,則該樣本為S2疫苗 株;如果測序結(jié)果峰圖為單一峰,與SEQIDNo. 3比對后在第369位點(diǎn)處多出25個(gè)核巧酸序 列燈CCCTCATAAATGGCTTTCTTCATA),則該樣本為除S2疫苗株W外的其他布魯氏菌野毒株或 疫苗株;如果測序結(jié)果與SEQ ID No. 3比對,在峰圖序列第369位點(diǎn)后出現(xiàn)套峰,則該樣本 為S2疫苗株和其他布魯氏菌株混合。
      [0052] 實(shí)施例二、PCR試劑盒的組裝 陽〇5引 (1)配制PCR反應(yīng)液:
      [0054] ①設(shè)計(jì)1對鑒定豬種布魯氏菌S2疫苗株的引物:為SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2, 命名為S2-F和S2-R,序列如下: 陽化5] S2-F :5' -CCTGCTGAGCGATGACCACCA-3' 陽化6] S2-R :5' -CCGCCAGAACATGCGATTTGA-3' 陽057] ②PCR反應(yīng)液的配制:PCR反應(yīng)液由豬種布魯氏菌S2疫苗株的引物和含有dNTPs、 Mg2\雙蒸水(d地2〇)的PCR緩沖液組成,PCR反應(yīng)液的總體積為44. 5 y L每條引物的量為 2化(引物濃度為10ymoL/L),含有dNTPs、Mg2\雙蒸水(d地2〇)的PCR緩沖劑的總量為 40. 5y以其中雙蒸水(dd&O)為27. 5yL。
      [0058] (2)陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品的制備:
      [0059] ①模板DNA的提?。悍謩e對豬種布魯氏菌疫苗株S2的菌液應(yīng)用細(xì)菌DNA提取試劑 盒提取DNA。 W60] ②PCR擴(kuò)增:W提取的DNA為模板,按照PCR反應(yīng)體系:DNA模板5 y L、DNA聚 合酶 0. SyL PCR反應(yīng)液44. 5yL PCR 反應(yīng)條件為:94°C 3min,94°C 30sec、60°C 30sec、 72°C 30sec,35個(gè)循環(huán),72°C lOmin,在PCR儀上擴(kuò)增目的片段,W 1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳 (120V 25min)鑒定PCR目的產(chǎn)物。
      [0061] ③重組質(zhì)粒的構(gòu)建及陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品的建立:將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化回收,然 后連接祀ASY-T3載體,轉(zhuǎn)化,提取質(zhì)粒后雙酶切鑒定,將陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行測序,并進(jìn)行序 列比對。序列正確的重組質(zhì)粒即為獲得的陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品。
      [0062] 所說的陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為豬種布魯氏菌S2疫苗株陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品。
      [0063] 所說的豬種布魯氏菌S2疫苗株陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品由含有539個(gè)堿基的核巧酸片段 連接到PEASY-T3載體后的重組質(zhì)粒構(gòu)成。 W64] 做陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品:陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為無菌雙蒸水,體積為5化。 陽0化]實(shí)施例=、布魯氏菌S2疫苗株鑒別試劑盒特異性試驗(yàn)
      [0066] 采用本發(fā)明的PCR試劑盒分別對豬種布魯氏菌S2、牛種布魯氏菌A19、羊種布魯 氏菌M5-90、綿羊種布魯氏菌63/290株,犬布魯氏菌RM6/66株,大腸桿菌0157:H7、小腸結(jié) 腸炎耶爾森菌0:9、沙口氏菌、金黃色葡萄球菌、牛分支桿菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增,并設(shè)陽性 與陰性對照,驗(yàn)證PCR反應(yīng)的特異性,PCR反應(yīng)條件為:94°C 5min,94°C 30sec、60°C 30sec、 72°C30sec,35個(gè)循環(huán),72°C lOmin。反應(yīng)結(jié)束后再進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化與測序。
      [0067] 豬種布魯氏菌S2疫苗株鑒別特異性結(jié)果如圖1所示,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果中:+ 為陽性質(zhì)巧柄準(zhǔn)品,1-5 :分別為豬種布魯氏困S2、牛種布魯氏困A19、羊種布魯氏困M5-90、 綿羊種布魯氏菌63/290株,犬布魯氏菌RM6/66株均擴(kuò)增出539bp的條帶,而-、6-10 :分 別為陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品、大腸桿菌〇157:H7、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌0:9、沙口氏菌、金黃色葡萄 球菌和牛分支桿菌均無條帶。序列測定后序列與峰圖比對結(jié)果如圖2所示,只有S2疫苗株 在369位點(diǎn)處存在25個(gè)核巧酸序列燈CCCTCATAAATGGCTTTCTTCATA)的缺失(圖2, A),其 他布魯氏菌株與疫苗株結(jié)果均為圖2-B所示。 W側(cè)實(shí)施例四、布魯氏菌陽性臨床樣本S2疫苗株的鑒別
      [0069] 分別對本實(shí)驗(yàn)室保存的布魯氏菌陽性樣本(已經(jīng)經(jīng)過PCR擴(kuò)增測序驗(yàn)證),包括2 份血液樣本、2份奶樣、2份流產(chǎn)胎兒組織樣本W(wǎng)及2份不同奶牛養(yǎng)殖場的牛舍氣溶膠樣本 進(jìn)行疫苗株的鑒別,結(jié)果如下表所示。
      [0070]
      【主權(quán)項(xiàng)】
      1. 一種用于鑒別豬種布魯氏菌疫苗株S2的引物對,其特征在于,兩條引物序列分別為 SEQ ID No. 1和 SEQ ID No. 2。2. 權(quán)利要求1所述的引物對用于制備鑒別和/檢測布魯氏菌的試劑盒、芯片的應(yīng)用。3. 權(quán)利要求1所述的引物對用于制備鑒別和/檢測豬種布魯氏菌疫苗株S2的試劑盒、 芯片的應(yīng)用。4. 包括權(quán)利要求1所述的引物對的試劑盒。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒,其特征在于,還包括:PCR反應(yīng)液、DNA聚合酶、陽性 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品。6. -種用于鑒別布魯氏菌的方法,其特征在于,包括如下步驟: (1) 提取待測樣本的基因組DNA ; (2) 以提取的樣本基因組DNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,所采用的引物為權(quán)利要求1所述 的引物對; (3) 取PCR產(chǎn)物,以瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測,觀察是否出現(xiàn)豬種布魯氏菌疫苗株S2擴(kuò) 增出的539bp及與之大小對應(yīng)的條帶; (4) 如果上述PCR檢測結(jié)果與目的條帶不符,則說明模板為布魯氏菌陰性,目的條帶相 符,則為布魯氏囷。7. -種鑒別布魯氏菌S2疫苗株與其他布魯氏菌的方法,其特征在于, (1) 提取待測樣本的基因組DNA ; (2) 以提取的樣本基因組DNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,所采用的引物為權(quán)利要求1所述 的引物對; (3) 取PCR產(chǎn)物,以瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測,觀察是否出現(xiàn)豬種布魯氏菌疫苗株S2擴(kuò) 增出的539bp及與之大小對應(yīng)的條帶; (4) 如果上述PCR檢測結(jié)果與目的條帶不符,則說明模板為布魯氏菌陰性,如果PCR檢 測條帶大小正確,則對陽性條帶進(jìn)行切膠回收純化,然后再進(jìn)行序列測定; (5) 結(jié)果判定:對使用SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2引物對純化的539bp及與之大小 對應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行測序,如果測序結(jié)果峰圖為單一峰,與SEQ ID No. 3比對后完全匹配,則該 樣本為S2疫苗株;如果測序結(jié)果峰圖為單一峰,與SEQ ID No. 3比對后在第369位點(diǎn)處多 出25個(gè)核苷酸序列,則該樣本為除S2疫苗株以外的其他布魯氏菌野毒株或疫苗株;如果測 序結(jié)果與SEQ ID No. 3比對,在峰圖序列第369位點(diǎn)后出現(xiàn)套峰,則該樣本為S2疫苗株和 其他布魯氏菌株混合。8. 權(quán)利要求6或7所述方法,其特征在于,所述待測樣本為血液、奶樣、組織樣本、氣溶 膠樣本。9. 權(quán)利要求6或7所述方法,其特征在于,PCR擴(kuò)增條件為:94°C 3min,94°C 30sec、 6(TC 30sec、72°C 30sec,35 個(gè)循環(huán),72°C IOmin0
      【專利摘要】本發(fā)明涉及一種鑒別布魯氏菌S2疫苗株與野毒株的試劑盒,其中包括用于鑒別布魯氏菌疫苗株S2的特異性引物對SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2;使用該試劑盒在通過PCR擴(kuò)增-電泳檢測區(qū)分布魯氏菌和其他常規(guī)細(xì)菌菌株后,對于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)一步測序分析,通過測序結(jié)果能夠快速有效的鑒別診斷臨床樣本中布魯氏菌S2疫苗株。
      【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
      【公開號】CN105002173
      【申請?zhí)枴緾N201510484411
      【發(fā)明人】何洪彬, 趙貴民, 王洪梅, 賈春濤
      【申請人】山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心
      【公開日】2015年10月28日
      【申請日】2015年8月7日
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