檢測脂肪肉瘤的小rna指紋圖譜及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明公開了一種小RNA(miRNA ;microRNA)指紋圖譜在脂肪肉瘤診斷中的用途， 屬于生物醫(yī)學(xué)、生物工程和檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪肉瘤（LP巧是一種常見的惡性軟組織腫瘤，起源于脂肪母細胞向脂肪細胞 分化的間葉細胞，故表現(xiàn)為不同分化程度的異型脂肪母細胞，均含有脂質(zhì)。根據(jù)腫瘤細胞 的分化程度和類型可W分為五種亞型：分化良好型（WDLP巧、去分化型值DLP巧、黏液樣型 (MLS)、圓形細胞型（RCL巧及多形性型（PLS)，但腫瘤中通常是多型細胞混合存在。從起源 來看，存在著脂肪組織的部位皆有可能發(fā)生脂肪肉瘤發(fā)生于肢體的病例占60%腹膜后間隙 占15%軀干部皮下15%，原發(fā)于肝臟的脂肪肉瘤極為罕見，至今所報道的肝臟原發(fā)性脂肪 肉瘤尚未超過10例。分化良好型和去分化型位于人類染色體12q，此位置還包括MDM2和 CDK4在內(nèi)。
[0003] 手術(shù)治療是脂肪肉瘤治療中的第一選擇。局部的廣泛切除，是減少復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的有 效措施。因為脂肪肉瘤淋己結(jié)轉(zhuǎn)移罕見，引流區(qū)淋己結(jié)清掃多無必要。有文獻報道除粘液 型和圓形細胞型脂肪肉瘤對放射治療較敏感，但是，總體來講放射治療不是治療脂肪肉瘤 的主要手段，多用于腫瘤邊緣切除的病人，防止局部復(fù)發(fā)，對于局部能行根治性切除或廣泛 切除的病人，術(shù)后放療意義不大。由于高分化脂肪肉瘤惡性度低，轉(zhuǎn)移的可能性小，化療意 義不大。對于惡性度較高的類型為術(shù)后防止轉(zhuǎn)移，可W行化療。由于現(xiàn)在尚無對脂肪肉瘤 特效的化療藥物，目前多采用聯(lián)合化療，常用的藥物有阿霉素ADM、順銷DDP、環(huán)憐酷胺CTX、 長春新堿VCR對于發(fā)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)移W前的微小轉(zhuǎn)移灶有治療意義。
[0004] 就脂肪肉瘤的診斷方法而言，最終要靠病理學(xué)的診斷，需要與惡性纖維組織細胞 瘤中的普通型和粘液型W及橫紋肌肉瘤中的多形性型鑒別開來。因此臨床上迫切需要為脂 肪肉瘤開發(fā)新的生物標(biāo)示物，W進行準(zhǔn)確的診斷和/或祀向治療。
[0005] miRNA現(xiàn)已成為研究RNA的一大熱點，其表達水平和腫瘤細胞的分化程度密切相 關(guān)。其在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控祀基因表達，具有廣泛的基因調(diào)節(jié)功能，可調(diào)芐基因活動各個層 面，如生長、分化、調(diào)亡等。最近，有文獻報道和LPS有關(guān)的miRNAs包括有miR-143扣gras S 等人；2011)，miR-155 狂hang P 等人；2012)，和 miR-486 度ajou K 等人，2004;Borjigin N 等人，2012)等。
[0006] 盡管目前已有部分關(guān)于脂肪肉瘤診斷和治療的研究，在臨床上脂肪肉瘤仍然很難 準(zhǔn)確診斷并得到有效治療，患者中觀測到的死亡率表明疾病的診斷、治療和預(yù)防仍需要改 進。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供有效的小RNA指紋圖譜，用于脂肪肉瘤診斷、腫瘤分級和 預(yù)后評價。
[0008] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離的miRNA，所述的miRNA為：
[0009] (i)序列如沈Q IDNO:n所示的miRNA，其中n為選自1-21的正整數(shù)；
[0010] (ii)與沈Q ID N0:n所示序列互補的miRNA ;
[0011] (化）序列如SEQ ID NO: 1-21所示的miRNA中的兩種或兩種W上的組合；或
[001引 （iv )與SEQ ID NO: 1-21所示序列互補的miRNA中的兩種或兩種W上的組合。
[0013] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種miRNA集合或組合，所述miRNA集合或組合包含序 列如沈Q ID NO: 1-2所示的2種miRNA。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述miRNA集合或組合還包含序列如SEQ ID N0:3所示的 miRNA。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述miRNA集合或組合還包含選自SEQIDNO: 4-9所示序列中 的至少2種miRNA。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述的miRNA分離自人。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的序列可通過化學(xué)合成或構(gòu)建真核細胞表達載體進行表達 獲得。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述miRNA集合或組合包含序列如SEQIDN0:l-7、9-ll所示的 10種miRNA ;或者
[0019] 所述miRNA集合或組合包含序列如沈Q ID NO: 1-5、9、12-15所示的10種miRNA ; 或者
[0020] 所述miRNA集合或組合包含序列如沈Q ID NO: 1-4、6、8、16所示的7種miRNA;或 者
[002。 所述miRNA集合或組合包含序列如沈Q ID NO: 1、2、8、17-21所示的8種miRNA。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述miRNA集合或組合為由十個miRNAs組成的小RNA指紋圖 譜，用于脂肪肉瘤組織的診斷、腫瘤分級和預(yù)后評價；
[0023]所述十個 miRNAs 為 hsa-miR-493#, hsa-miR-145, hsa-miR-486-5。，hsa-miR -329, hsa-miR-130b,hsa-miR-369-3p, hsa-miR-144#, hsa-miR-381, hsa-miR-376b 和 hsa-miR-496。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述十個miRNAs組成的小RNA指紋圖譜中，各miRNA在脂肪 肉瘤組織和正常脂肪組織中表達倍數(shù)差異大于2,其中5種在脂肪肉瘤組織組織中上調(diào) 化sa-miR-493#，hsa-miR-26a_2#, hsa-miR-329, hsa-miR-369-化和 hsa-miR-49f5) ;5 種在 脂肪肉瘤組織中下調(diào)化sa-miR-486-5p, hsa-miR-486-化，hsa-miR-144#, hsa-miR-195 和 hsa-miR-145);由此從脂肪組織中區(qū)分出脂肪肉瘤組織。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述miRNA集合或組合為由十個miRNAs組成的小RNA指紋圖 譜，用于脂肪肉瘤組織的診斷、腫瘤分級和預(yù)后評價；和/或用于從正常脂肪組織中區(qū)分出 脂肪肉瘤組織；
[0026]所述十個 miRNAs 為 hsa-miR-493#，hsa-miR-369-3。，hsa-miR- 329, hsa-mi R-130b, hsa-miR-381, hsa-miR-376b, hsa-miR-496, hsa-miR-145, hsa-miR-486-5p 和 hsa-miR-144#。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述十個miRNAs組成的小RNA指紋圖譜中，各miRNA在脂 肪肉瘤組織和正常脂肪組織中表達倍數(shù)差異大于2,其中7種上調(diào)化sa-miR-493#， hsa-miR-369-3p，hsa-miR-329, hsa-miR-130b, hsa-miR-381,hsa-miR-376b,和 hsa-miR-496) ;3 種下調(diào)化sa-miR-145, hsa-miR-486-5p 和 hsa-miR-144#);由此區(qū)分脂肪 肉瘤組織和正常脂肪組織。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述miRNA集合或組合為由屯個miRNAs組成的小RNA指紋圖 譜，用于脂肪肉瘤組織的診斷、腫瘤分級和預(yù)后評價；和/或從瘤旁脂肪組織中區(qū)分出脂肪 肉瘤組織；
[0029]所述屯個 miRNAs 為 hsa-miR-SGa-2#，hsa-miR-486-5。，hsa-miR- 486-化，hsa-miR -144#，hsa-miR-4732-3p, hsa-miR-451和 hsa-miR-145。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述屯個miRNAs組成的小RNA指紋圖譜中，各miRNA在脂肪肉 瘤組織和正常脂肪組織中表達倍數(shù)差異大于2,其中1種上調(diào)化sa-miR-26a-2#) ;6種下 調(diào)化sa-miR-486_5p, hsa-miR-486-化，hsa-miR-144#, hsa-miR-4732-3p, hsa-miR-451 和 hsa-miR-145);由此區(qū)分脂肪肉瘤組織和瘤旁脂肪組織。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述miRNA集合或組合為由八個miRNAs組成的小RNA指紋圖 譜，用于脂肪肉瘤組織的診斷、腫瘤分級和預(yù)后評價；和/或用于脂肪肉瘤組織的分型（如 用于區(qū)分去分化型脂肪肉瘤組織與分化良好型脂肪肉瘤組織）；
[0032]所述八個 miRNAs 為 hsa-miR-144#，hsa-miR-45l，hsa-miR-2%- 2#，hsa-miR-365， hsa-miR-29b, hsa-miR-499-5p, hsa-miR-486-5p 和 hsa-miR-55化。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述八個miRNAs組成的小RNA指紋圖譜中，各miRNA在脂肪肉 瘤組織和正常脂肪組織中表達倍數(shù)差異大于2,且均在去分化型脂肪肉瘤組織中下調(diào)化sa -miR-144#, hsa-miR-451, hsa-miR-29b-2#, hsa-miR-365, hsa-miR-29b, hsa-miR-499-5p, h sa-miR-486-5p和hsa-miR-55化）；由此區(qū)分去分化型脂肪肉瘤組織和分化良好型脂肪肉 瘤組織。
[0034] 本發(fā)明的第=方面，提供了一種分離的或人工構(gòu)建的前體miRNA,所述的前體 miRNA能在人細胞內(nèi)剪切并表達成本發(fā)明第一方面所述的miRNA。
[0035] 本發(fā)明還提供一種分離的或人工構(gòu)建的前體miRNA集合或組合，所述的前體 miRNA集合或組合中的前體miRNA能在人細胞內(nèi)剪切并表達成本發(fā)明第二方面所述的 miRNA集合或組合中的miRNA。
[0036] 本發(fā)明的第四方面，提供了一種分離的多核巧酸，所述的多核巧酸能被人細胞轉(zhuǎn) 錄成前體miRNA,所述的前體miRNA能在人細胞內(nèi)被剪切且表達成本發(fā)明第一方面所述的 miRNA ；
[0037] 較佳地，所述的多核巧酸具有式I所示的結(jié)構(gòu)：
[0038] Seq 正向-X-Seq 反向 式 I，
[0039]式 I 中，
[0040] Seq正向為能在人細胞中表達成所述的miRNA的核巧酸序列，
[0041] Seq反向為與Seq正向基本上互補或完全互補的核巧酸序列；
[004引X為位于Seq正向和Seq反向之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq正向和 Seq反向不互補，
[0043] 并且式I所示的結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)入人細胞后，形成式II所示的二級結(jié)構(gòu)：
[0044]
[004引式II中，Seq正向、Seq反向和X的定義如上述，
[0046] II表示在Seq正向和Seq反向之間形成的堿基互補配對關(guān)系。
[0047] 本發(fā)明還提供一種分離的多核巧酸集合或組合，所述的多核巧酸集合或組合包括 能被人細胞轉(zhuǎn)錄成前體miRNA的多核巧酸，所述的前體miRNA能在人細胞內(nèi)被剪切且表達 成本發(fā)明第二方面所述的miRNA集合或組合。
[0048] 在另一優(yōu)選例中，所述的多核巧酸集合或組合中的一種或多種多核巧酸具有式I 所示的結(jié)構(gòu)：
[0049]Seq 正向-X-Seq 反向 式 I，
[0050]式 I 中，
[0051] Seq正向為能在人細胞中表達成所述的miRNA的核巧酸序列，
[0052] Seq反向為與Seq正向基本上互補或完全互補的核巧酸序列；
[005引 X為位于Seq正向和Seq反向之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq正向和 Seq反向不互補，
[0054]并且式I所示的結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)入人細胞后，形成式II所示的二級結(jié)構(gòu)：
[00 巧]
[0056] 式II中，Seq正向、Seq反向和X的定義如上述，
[0057] II表示在Seq正向和Seq反向之間形成的堿基互補配對關(guān)系。
[0058] 本發(fā)明的第五方面，提供了一種載體，它含有本發(fā)明第一方面所述的分離的 miRNA、或本發(fā)明第二方面所述的miRNA集合或組合，或本發(fā)明第四方面的多核巧酸。
[0059] 本發(fā)明的第六方面，提供了本發(fā)明第一方面所述的分離的miRNA、或本發(fā)明第二方 面所述的miRNA集合或組合的用途，用于制備忍片或試劑盒；所述忍片或試劑盒用于：
[0060](1)脂肪肉瘤組織的診斷、腫瘤分級和預(yù)后評價；
[0061] (2)從正常脂肪組織中區(qū)分出脂肪肉瘤組織；
[0062] (3)從瘤旁脂肪組織中區(qū)分出脂肪肉瘤組織；和/或
[0063] (4)區(qū)分去分化型脂肪肉瘤組織與分化良好型脂肪肉瘤組織。
[0064] 本發(fā)明的第屯方面，提供了一種miRN