bp)序列，可用定量PCR進(jìn)行病 毒滴度檢測(cè)。
[0048] h細(xì)polyA引物正義鏈：5' -CAAGCGATTCTCCTGCCTCA-3，
[0049] h細(xì)polyA引物反義鏈：5'-ACGCCTGTAATCCCAGCAAT-3，
[0050]常規(guī)反應(yīng)條件：1 個(gè)循環(huán)（50 °C，2min;95 °C，lOmin)，40 個(gè)循環(huán)（95 °C，30s; 60°C，30s)。反應(yīng)體系見(jiàn)表2 :
[0051] 表2定量PCR檢測(cè)病毒滴度反應(yīng)體系
[0052]
[0053]
[0054] 3)將樣品cT值依標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行比對(duì)，所得結(jié)果即為對(duì)應(yīng)病毒核酸拷貝數(shù)。 陽(yáng)化5] 依公式：
[0056] 病毒基因組拷貝數(shù)/毫升（vg/ml)=(病毒核酸拷貝數(shù) /2 y 1) X巧0 y 1/2 y 1) X lmL/200 y 1X稀釋度，計(jì)算每毫升病毒液中病毒基因組拷貝數(shù)。
[0057] 滴度檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3 :
[0058] 表3病毒滴度檢測(cè)結(jié)果
[0059]
[0060] 5、rAAV9-ZsGreen-化RNA-Kifll重組腺相關(guān)病毒對(duì)腎上腺嗜銘細(xì)胞瘤PC12的 Kif 11基因表達(dá)的抑制作用 W61] 1) PC 12細(xì)胞培養(yǎng) 陽(yáng)06引常規(guī)將腎上腺嗜銘細(xì)胞瘤PC12接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，加入1640培養(yǎng)基（含10% 胎牛血清），37°C，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)成均勻單層細(xì)胞并達(dá)90% W上聚集度時(shí)傳 代。W含10%胎牛血清的1640調(diào)整細(xì)胞密度后重新接種于6孔板中，密度為8X 105/孔， 置于37°C、5% C〇2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0063] 2)重組腺相關(guān)病毒感染PC12細(xì)胞
[0064] 將培養(yǎng)細(xì)胞分成兩組：對(duì)照組用rAAV9-ZsGreen-shRNA-Scramble轉(zhuǎn)染PC12細(xì) 胞；shRNA干擾組rAAV9-ZsGreen-化RNA-Kifll轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。逐滴加 入到含有細(xì)胞和完全培養(yǎng)基的6孔板中，輕柔混勻。37°C培養(yǎng)箱中解育48h。
[00化]3)樣品制備
[0066] 提取總RNA(具體實(shí)驗(yàn)方法參見(jiàn)試劑說(shuō)明）。腺相關(guān)感染4化后，吸盡培養(yǎng)基，PBS 洗涂，每孔（直徑3. 5cm)加入ImL Trizol后，靜置2分鐘，吹打裂解細(xì)胞。裂解液轉(zhuǎn)入EP 管中，在室溫放置5分鐘；加入0. 2mL氯仿，顛倒混勻15秒，低溫離屯、15分鐘。上清置于新 EP管中，加異丙醇（1血TRIZ化加0. 5血）入，在室溫下（15°C~30°C)放置10分鐘，12000 轉(zhuǎn)（2°C~8°C )離屯、10分鐘；棄上清，75%乙醇洗涂，低溫離屯、5分鐘，棄上清；RNA沉淀物 在室溫干燥；用化ase-化ee water溶解RNA沉淀，定量后-80°C超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0067] 4)cDNA模板的合成
[0068] 反應(yīng)體系見(jiàn)表4,在離屯、管中輕輕將各種成分混合，37°C下解育2分鐘。在室溫下 加入1 y 1 (200單位）M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，輕吹打混勻。37°C解育50分鐘。在70°C加熱15分 鐘W終止反應(yīng)。cDNA產(chǎn)物直接作為q-PCR的模板。 W例表4 cDNA模板反應(yīng)體系[0070]
陽(yáng)0川5)PCR反應(yīng) 陽(yáng)072] 引物設(shè)計(jì)：大鼠Kim (16化P)，
[0073]正義鏈（f):5, -TGGACGTTCACAAAGCACTG-3，
[0074]反義鏈（r) :5'-GCTGCTAACGACTGCTCTTC-3，
[00"75]內(nèi)參：b-actin (240bp)
[0076]正義鏈（f)5,-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3，
[0077]反義鏈（r):5, -TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3， 陽(yáng)07引 常規(guī)反應(yīng)條件：1個(gè)循環(huán)（50 °C，2min ;95 °C，lOmin)，40個(gè)循環(huán)（95 °C，30s; 60°C，30s)，反應(yīng)體系見(jiàn)表5 : 陽(yáng)0巧]表5 Kifll基因表達(dá)PCR檢測(cè)體系[0080]
[0081] rAAV9-ZsGreen-aiRNA-Kifll重組腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染對(duì)Kifll基因表 達(dá)的抑制作用，與scramble對(duì)照組相比，抑制率達(dá)68 %，參見(jiàn)圖2, PCR檢測(cè) rAAV9-ZsGreen-化RNA-Kifll重組腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞PC12后Kim mRNA相對(duì)表達(dá) 量。圖中，1 為 Marker,從上到下 2000bp, 1000bp，750bp，500bp，250bp，lOObp。其中，（a)為 Kifll，（b)為內(nèi)參 P-actin。
[0082] 6、MIT法檢測(cè)干擾病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響
[0083] 常規(guī)培養(yǎng)42058細(xì)胞（41(：〇，^〇.125%膜蛋白酶消化42058細(xì)胞成單細(xì)胞懸液， 分于96孔板，每孔lOOiil。37°C、5% C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)化后，棄上清，每孔加入200 yl無(wú) 血清培養(yǎng)基，病毒液轉(zhuǎn)染2地（分為對(duì)照scramble組和shRNA組）。棄上清，加胎牛血清培 養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h加入20ul M1T溶液巧mg/mL)，培養(yǎng)地。棄上清，每孔150 y 1二甲基亞 諷，搖床lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀490nm處測(cè)量各孔的吸光值。
[0084] 計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率％=[1-A(實(shí)驗(yàn)組）/A(對(duì)照組）]X 100% 陽(yáng)0化]shRNA處理組對(duì)黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率顯著提高，參見(jiàn)圖3,結(jié)果表明：shRNA處理 組對(duì)黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率顯著高于scramble對(duì)照組，提示Kin 1干擾shRNA具有抗腫瘤 增殖的作用。
[0086] 綜上所述，本發(fā)明提供的大鼠Kin 1基因干擾shRNA及其重組腺相關(guān)病毒，其正義 鏈和反義鏈的核巧酸序列如SEQ. ID. NO. 1和SEQ. ID. NO. 2所示。
[0087] 含有Kif 11基因干擾shRNA的重組腺相關(guān)病毒的制備，包括W下步驟：
[0088] (1)根據(jù)大鼠Kif 11基因設(shè)計(jì)合成shRNA序列；
[0089] 似將干擾序列導(dǎo)入rAAV9-ZsGreen-aiRNA質(zhì)粒載體；
[0090] (3)將目的片段rAAV9-ZsGreen-化RNA-Kifll構(gòu)建入9型重組腺相關(guān)病毒。
[0091] 本發(fā)明提供的rAAV9-ZsGreen-化RNA-Kifll重組腺相關(guān)病毒滴度高，每毫升含有 IX 10"慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒，能抑制腎上腺嗜銘細(xì)胞瘤Kifll基因的表達(dá)，該干擾重組病毒能 顯著降低腫瘤細(xì)胞PC12細(xì)胞Kif 11基因表達(dá)，抑制率達(dá)68%，能抑制惡性腫瘤細(xì)胞的增殖 反應(yīng)，因此在腫瘤治療方面具有應(yīng)用前景。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種大鼠Kifll基因干擾shRNA，其特征在于，shRNA正義鏈的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示；shRNA反義鏈的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。2. 含有權(quán)利要求1所述的大鼠Kifll基因干擾shRNA序列的重組腺相關(guān)病毒 rAAV9-ZsGreen-ShRNA-Kifl1。3. 如權(quán)利要求2所述的重組腺相關(guān)病毒rAAV9-ZsGreen-ShRNA-Kifl 1，其特征在于，該 重組腺相關(guān)病毒rAAV9-ZsGreen-ShRNA-Kifll為9型重組腺相關(guān)病毒。4. 權(quán)利要求2所述的重組腺相關(guān)病毒rAAV9-ZsGreen-ShRNA-Kifll在制備抗腫瘤藥物 中的應(yīng)用。5. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物為抑制腫瘤細(xì)胞Kifll基因表達(dá) 的藥物。6. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物為抗腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤的藥物。7. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物為抑制腫瘤細(xì)胞增殖的藥物。8. 如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物為抗黑色素瘤的藥物。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種大鼠Kif11基因干擾shRNA及其重組腺相關(guān)病毒和抗腫瘤應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的大鼠Kif11基因干擾shRNA，shRNA正義鏈的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；shRNA反義鏈的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。本發(fā)明還提供了含有大鼠Kif11基因干擾shRNA序列的重組腺相關(guān)病毒rAAV9-ZsGreen-ShRNA-Kif11，病毒滴度高，每毫升含有1×1013病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒，能顯著抑制腫瘤細(xì)胞Kif11基因表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖反應(yīng)，在腫瘤治療方面具有應(yīng)用前景。
【IPC分類(lèi)】C12N15/113, A61K31/713, C12N7/01, A61P35/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105002181
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510427165
【發(fā)明人】于耀清, 王歡
【申請(qǐng)人】中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年10月28日
【申請(qǐng)日】2015年7月20日