無抗性雙功能dna疫苗載體、構(gòu)建方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種無抗性雙功能DNA疫苗載體，同時還設(shè)及該DNA疫苗載體的構(gòu)建 方法和應(yīng)用，屬于動物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] DNA疫苗值NA vaccine)又稱核酸疫苗或基因疫苗（genetic vaccine)，它的發(fā)現(xiàn) 被譽為第S次疫苗革命。DNA疫苗可W誘導(dǎo)機體的細(xì)胞免疫和體液免疫，其制備簡單，生產(chǎn) 成本低，遺傳背景清晰，便于構(gòu)建多價苗和添加多種免疫佐劑分子等。目前大多數(shù)的質(zhì)粒載 體都W抗生素抗性基因作為其選擇性標(biāo)記，運一環(huán)境安全性問題嚴(yán)重制約著DNA疫苗的發(fā) 展和應(yīng)用。伴隨著抗生素的廣泛應(yīng)用甚至是濫用，抗生素耐藥性基因的擴散問題日益嚴(yán)重， 現(xiàn)已成為全球共同關(guān)注的問題。耐藥性基因不斷向環(huán)境中漂移擴散，不僅破壞微生態(tài)平衡， 還導(dǎo)致超級細(xì)菌的出現(xiàn)（如NDM-1)。近年來出現(xiàn)的多種超級細(xì)菌就是由抗性基因的擴散引 起，在臨床上無藥可醫(yī)，給社會帶來極大恐慌。而無抗性DNA疫苗載體的構(gòu)建能夠避免抗性 基因擴散所帶來的一系列問題。
[0003] 利用減毒沙口菌作為載體傳遞DNA疫苗是目前基因免疫研究的熱點。減毒沙口 菌擁有一個有效的運送重組抗原的系統(tǒng)，運些抗原可來自多種病原體，包括細(xì)菌、病毒和寄 生蟲的抗原，甚至腫瘤抗原（潘志明，唐麗華，黃金林等.作為疫苗和疫苗載體的減毒細(xì) 菌.微生物學(xué)雜志，2005, 25巧）：78-82.)。應(yīng)用基因工程技術(shù)對沙口菌減毒后，雖然其毒 力降低，但其侵襲力并未發(fā)生明顯的改變，可將DNA疫苗直接運送到抗原遞呈細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo) 機體產(chǎn)生體液免疫、黏膜免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，使機體不僅能抵抗相應(yīng)外源病原的攻擊，同 時還能抵抗沙口菌的感染，運使得減毒沙口菌成為攜帶病毒或細(xì)菌DNA的有效載體化i Y H, Wang S F,Xin W, et al.A sopB Deletion Mutation Enhances the Immunogenicity and Protective Efficacy of a Heterologous Antigen Delivered by Live Attenuated Salmonella enterica Vaccines. Infection And Immunity, 2008,76(11):5238-5246.)。減 毒沙口菌重組DM疫苗免疫動物時，通過口服途徑即可刺激黏膜免疫，操作簡單方便，并且 其向宿主免疫系統(tǒng)遞呈抗原蛋白的方式與自然感染相似。同時，沙口菌脂多糖具有免疫佐 劑的作用，能夠增強免疫應(yīng)答（國鳳英，盧±紅，許自亮等.口服攜帶人PF4基因的減毒沙 口氏菌對大劑量化療小鼠的促造血重建作用.中國生物工程雜志，2005, 25(2) : 12-18.)。 減毒沙口菌重組DNA疫苗制備簡單（只需培養(yǎng)細(xì)菌），生產(chǎn)成本低，將為新型口服DNA疫苗 的研制提供一條新的思路。目前，減毒沙口菌已廣泛用于細(xì)菌、病毒、寄生蟲、腫瘤等疫苗載 體。實驗結(jié)果證明多數(shù)減毒沙口菌株作為載體傳遞DNA疫苗具有良好的免疫原性，能夠起 到良好的免疫效果（李文桂，陳雅棠.細(xì)菌重組減毒鼠傷寒沙口氏菌疫苗研究進(jìn)展.動物 醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2004, 25 (2) : 49-53.)。
[0004] 因此，構(gòu)建W營養(yǎng)選擇標(biāo)志基因asd代替抗性基因作為選擇壓力的沙口氏菌染色 體-質(zhì)粒平衡致死系統(tǒng)有著十分重要的意義，可用于研制新型無抗性口服DNA疫苗，具有巨 大的市場價值和廣闊的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽0化]本發(fā)明的目的是提供一種無抗性雙功能DNA疫苗載體，W營養(yǎng)選擇標(biāo)志基因asd 替代抗生素抗性基因，從根本上消除抗生素抗性基因擴散所帶來的安全性問題。
[0006] 同時，本發(fā)明還提供一種無抗性雙功能DNA疫苗載體的構(gòu)建方法。
[0007] 最后，本發(fā)明還提供一種無抗性雙功能DNA疫苗載體在制備無抗性DNA疫苗中的 應(yīng)用。
[000引為了實現(xiàn)W上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0009] 無抗性雙功能DNA疫苗載體，該載體為真核表達(dá)質(zhì)粒，全長4058bp (圖譜見圖1，A、 B分別展示不同的酶切位點），其核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。其中，1732~2872bp為 SD-asd 基因片段，2873 ~3970bp 為 pUCori 片段，其余為化mv-MCS-BGHpA-f lori 片段，。
[0010] 無抗性雙功能DNA疫苗載體的構(gòu)建方法，包括W下步驟：
[0011] 1) W平衡致死系統(tǒng)載體PYA3493質(zhì)粒為模板，擴增SD-asd基因；
[0012]2)用BspHI和XmnI雙酶切真核表達(dá)質(zhì)粒PCDNA3. 1-Zeo (+)，去除Amp抗性基因， 回收 1814bp 的片段 F^cmv-MCS-BGHpA-flori;
[0013]3)用XmnI和Sail雙酶切真核表達(dá)質(zhì)粒PCDNA3.1-Zeo (+)，去除Zeo抗性基因，回 收 1099bp 的片段 pUCori;
[0014] 4)將 SD-asd 基因、Pcmv-MCS-BGHpA-n〇ri、pUCori 進(jìn)行連接，構(gòu)建長度為 4058bp 的無抗性雙功能DM疫苗載體。
[0015] 步驟1)中擴增SD-asd基因的引物序列如沈Q ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示。
[0016] 無抗性雙功能DNA疫苗載體在制備無抗性DNA疫苗中的應(yīng)用。例如在無抗性雙 功能DNA疫苗載體的多克隆位點插入（人或動物疾?。┩庠幢Ｗo(hù)性抗原基因，并將其應(yīng)用 到asd基因缺陷的革蘭氏陰性菌群中，尤其是asd基因缺失的減毒沙口氏菌中，構(gòu)建沙口氏 菌染色體-質(zhì)粒平衡致死系統(tǒng)，制備無抗性DNA疫苗。沙口氏菌asd基因缺失菌株如采用 鼠傷寒沙口菌化1344 A crp A asd菌株（田芳華，程相朝等.鼠傷寒沙口菌化1344株 A C巧A asd缺失株的構(gòu)建及生物學(xué)特性初步研究，中國獸醫(yī)學(xué)報，2013, 11:1700-1706.)。
[0017] 本發(fā)明的有益效果：
[0018] 本發(fā)明利用營養(yǎng)選擇標(biāo)志替代抗生素抗性基因作為無抗性雙功能DNA疫苗載體 的篩選標(biāo)記（抗生素抗性基因被完全切除），構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcD-asd，能從根本上阻斷 抗生素抗性基因的擴散傳播，安全性好，并且具有高表達(dá)效率和高拷貝數(shù)。運是由于DNA疫 苗載體pcD-asd的SD-asd基因缺少相應(yīng)的啟動子，僅保留SD序列，搭配高效的復(fù)制起始點 PUCori,能夠增加該質(zhì)粒的拷貝數(shù)。
[0019] 本發(fā)明中無抗性雙功能DNA疫苗載體能夠與asd基因缺陷的革蘭氏陰性菌（如減 毒沙口氏菌鼠傷寒化1344 A C巧A asd)互補，構(gòu)建染色體-質(zhì)粒平衡致死系統(tǒng)，該系統(tǒng)感 染293T細(xì)胞后，可觀察到較強的巧光，同時該系統(tǒng)可在普通的LB培養(yǎng)基上連續(xù)傳70次，質(zhì) 粒不丟失，證實該系統(tǒng)在真核細(xì)胞內(nèi)高效穩(wěn)定表達(dá)外源基因，可用作核酸疫苗的表達(dá)載體。
[0020] 本發(fā)明中真核表達(dá)質(zhì)粒pcD-asd可利用減毒傷寒沙口氏菌為載體構(gòu)建雙價、多價 活菌苗，該種疫苗無任何抗性標(biāo)記，遺傳背景清晰，性狀穩(wěn)定，制備簡便，易于體外大規(guī)模培 養(yǎng)，可經(jīng)口服接種途徑進(jìn)行免疫，使用方便，安全性好，成本低，可發(fā)揮減毒沙口菌活載體的 天然免疫佐劑效應(yīng)及誘導(dǎo)機體產(chǎn)生強烈的特異性細(xì)胞免疫和粘膜免疫應(yīng)答能力的優(yōu)勢，從 而增強DNA疫苗的免疫效果，具有顯著的經(jīng)濟和社會效益。同時，還能降低抗生素抗性基因 擴散的潛在危險性，從根本上消除擴散所帶來的安全性問題。
【附圖說明】 陽02U 圖1為本發(fā)明無抗性雙功能DM疫苗載體的圖譜； 陽02引圖2為無抗性雙功能DNA疫苗載體的構(gòu)建示意圖； 陽〇2引 圖3為SD-asd基因片段電泳圖；
[0024] 圖4為HN基因PCR產(chǎn)物的電泳圖；
[0025] 圖5為重組質(zhì)粒pcD-asd-HN酶切電泳圖； 陽0%] 圖6為重組質(zhì)粒pcD-asd酶切電泳圖；
[0027] 圖7為重組質(zhì)粒pcD-asd穩(wěn)定性試驗電泳圖；
[0028] 圖8為重組質(zhì)粒pcD-asd-EGFP酶切電泳圖；
[0029] 圖9為質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞巧光顯微圖；
[0030] 圖10為重組減毒沙口菌感染293T細(xì)胞的巧光顯微圖。
【具體實施方式】
[0031] 下述實施例僅對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。 陽0巧實施例1 陽03引本實施例中無抗性雙功能DNA疫苗載體pcD-asd是基于PCDNA3. 1-Zeo (+)改造構(gòu) 建的，構(gòu)建示意圖見圖2,具體操作如下：
[0034]1)擴增非抗生素抗性基因天冬氨酸P -半乳糖脫氨酶（SD-asd)，W平衡致死系統(tǒng) 載體PYA3493質(zhì)粒（美國華盛頓大學(xué)化.Roy ^diss III教授惠贈）為模板，根據(jù)已發(fā)表 的平衡致死系統(tǒng)載體PYA3493質(zhì)?；蛐蛄校O(shè)計一對分別引入XmnI、Sail限制性內(nèi)切酶 酶切位點的上、下游引物（分別如SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示）：
[0035]上游引物：5' -CGGAATTAATTCgcacatctctttgcagg-3^ 狂mnl 酶切位點），
[0036]下游引物：5' -ACGC GTCGAC ctacgccaactggcgcag-3' (Sail 酶切位點），
[0037]用 rTaq 酶 PCR 擴增 SD-asd 基因。擴增體系為：10XPCR Buffer 2. 5 y L ;dNTPs 各（200umol/L) 1 y L jTaq 酶 2U/ y L;上游引物 / 下游引物各 lOOpmol ;Mg2+l. 5mmol/L 0. 5 y L ;模板（PYA3493) 2ug ;加 d地2〇 至 25 y L。擴增程序為：94°C，5min ;94°C，Imin ;56°C， Imin ;72°C，Imin ;30個循環(huán)；72°C，lOmin。擴增出的目的條帶大小為ll"bp (含酶切位 點）（見圖3,圖中M:DL2000Mark;l :水對照；2,3 :SD-asd基因片段），連接PMD19-T載體。 連接體系為：PMD19-T 巧Ong/ul) 0. 5 y L ;T4DNA 連接酶 2. 5U/ y L 5. 0 y L ;SD-asd 基因片段 0. 5pmol;加d地2〇至lOL。采用常規(guī)的熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,挑選陽性單菌落送上海 英驗生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序； 陽0測 2)pcDNA3. l-Zeo(+)載體氨卞基因（Amp抗性基因）的去除
[0039] a)Bs抑I、XmnI雙酶切PCDNA3. 1-Zeo (+)載體，酶切反應(yīng)體系如下：
[0040]
[0041] 37°C解育4小時后，加入終止液混勻終止反應(yīng)；
[0042] b)瓊脂糖電泳，回收ISOObp左右的大片段化mv-MCS-BGHpA-n〇ri，4°C保存?zhèn)?用；
[0043] 3)pcDNA3. 1-Zeo(+)載體病毒復(fù)制相關(guān)部分SV40ori、SV40pA及博來霉素抗性基 因的去除
[0044] a) BspHI酶切PCDNA3. 1-Zeo(+)載體，酶切反應(yīng)體系如下：
[0045]
[0046] 37°C解育4小時后，加入終止液混勻終止反應(yīng)；
[0047] b)瓊脂糖電泳，回收4000bp左右PCDNA3. 1-Zeo (+) -AmpR片段（表示切除）， 回收產(chǎn)物測定濃度，4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0048] C)Sail酶切PCDNA3. 1-Zeo (+) -AmpR片段，酶切反應(yīng)體系如下：
[0049]
[0050] d)瓊脂糖電泳，回收llOObp左右pUCori片段，4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0051] 4)SD-asd基因片段、pUCori片段及化mv-MCS-BGHpA-flori片段的連接，反應(yīng)體系 如下：
[0052]
[0053]在加入連接酶之前，混合液于45°C保溫5min后立即冷卻至0°C，再加入10 X反應(yīng) 緩沖液和T4DNA連接酶混勻16 °C連接過夜后加入終止液終止反應(yīng)；
[0054] 5)SD-asd基因片段、pUCori片段及化mv-MCS-BGHpA-f lori片段的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 X6097 陽化5] 從-70°C冰箱內(nèi)取出大腸桿菌X6097感受態(tài)細(xì)胞，于冰上融化，將10 y L連接產(chǎn)物 與100化感受態(tài)細(xì)胞小屯、無菌混勻，之后轉(zhuǎn)移至1個無菌試管中，冰浴30min，再42 °C熱 激90s，立即放入冰水中靜置2. 5min (2~3min均可），加入500 y L預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基， 37°C 15化/min振搖培2.化(2~化均可），將培養(yǎng)液均勻涂布LB固體培養(yǎng)基（預(yù)熱），37°C 培養(yǎng)過