一株高產(chǎn)5-kga的氧化葡萄糖桿菌基因工程菌及其制備方法和應(yīng)用【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明設(shè)及一種葡萄糖酸桿菌Gluconobacter基因工程菌及其應(yīng)用，特別是過表達膜結(jié)合山梨醇脫氨酶W及輔酶PQQ和呼吸鏈末端電子受體，提高5-酬基-D-葡萄糖酸(5-keto-D-gluconicacid,5-KGA)的工程菌及應(yīng)用，屬于基因工程和發(fā)酵工程
技術(shù)領(lǐng)域：
?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]5-酬基-D-葡萄糖酸巧-ket〇-D-gluconicacid,5-KGA)是一種重要的中間體化合物。20世紀(jì)40年代末期，Gray通過5-KGA合成Vc，并申請專利US2421611，US2421612。后來又有專利報道5-KGA合成木糖二酸，如US5731467,合成芳香物質(zhì)4-徑基-5-甲基-2,3-二徑基巧喃酬，如US4464409。更主要的是5-KGA可W通過化學(xué)催化制備k(+)-酒石酸（JournalofAmericanQiemicalSociety,1933,55,3563，US2380196，W09615095A1，GB2388368)。氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacteroxydans)62IH能耐受高濃度的葡萄糖，并W葡萄糖為底物，不完全氧化為葡萄糖酸（gluconicacid,GA)，進一步氧化為2-酬基-D-葡萄糖酸（2-keto-D-gluconicacid,2-KGA)或者5-KGA。[0003]德國化lich研究中屯、對GluconobacteroxydansDSM2343進行基因修飾，如GASDH基因（葡萄糖酸-S-脫氨酶（gluconate-S-dehy化ogenase)基因）的失活、GA5DH基因的過表達、表達啟動子的改造等，構(gòu)建工程菌G.oxydansMF1/pBBRlMCS5-PtufB-ga5化，最終5-KGA的產(chǎn)量達300mM，約58.2g/L(AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2006,73(2),443-451)。日本山口大學(xué)Saichana等篩選到一株耐熱性Gluconobacter,并插入抗性基因失活GA2DH，最終5-KGA產(chǎn)量為190mM，約36.86g/L(AppliedandElnviromentalMicrobiology,2009,75(13),4240-4247)。浙江大學(xué)李博義等研究G.oxydansCGMCC1.637的發(fā)酵工藝條件，在恒定抑5.5,溶氧控制15%的條件下，流加補葡萄糖，最終5-KGA產(chǎn)量達到75.5g/l，轉(zhuǎn)化率超過70%(生物工程學(xué)報，2014,30巧)，1486-1490);天津科技大學(xué)譚之磊等W2-KGA缺陷型的GluconobacteroxydansHGI-1為出發(fā)菌株，研究碳、氮源對5-KGA合成的影響，化發(fā)酵罐中進行分批發(fā)酵放大試驗，5-KGA的產(chǎn)量為93.80g/l，平均生成速率為1.56g/L?h。[0004]2005年Gluconobacteroxydans62IH的基因組序列公布（NC_006677)，化UireBiotechnology,23(2)，195-200。參與葡萄糖代謝生成5-KGA的2個關(guān)鍵酶分別是膜結(jié)合蛋白葡萄糖脫氨酶（membrane-boundglucosedehy化ogenase,mGDH)和膜結(jié)合山梨醇脫氨酶（membrane-boundsorbitoldehy化ogenase,SLDH)，其均W化咯哇口林釀（pyrroloquinolinequinone,PQ曲為輔酶，傳送電子至呼吸鏈泛釀（ubiquinone)，最后經(jīng)末端電子受體細胞色素b〇3氧化酶（巧toe虹omeb〇3〇xidase)氧化，使電子從泛釀傳遞給分子氧，并產(chǎn)生質(zhì)子梯度電勢。2013年，Meyer和Ric化ar化分別研究了輔酶PQQ及細胞色素b〇3氧化酶在過表達膜結(jié)合蛋白時的作用，發(fā)現(xiàn)PQQ的量是影響脫氨酶氧化底物的重要因素，而細胞色素b〇3氧化酶是呼吸鏈電子傳遞的限速因子（AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2013,97,3457-3466;JournalofBacteriology,2013,195(18),4210-4220)。2013年，陳堅等申請專利CN103484417A，在G.oxydansWSH-003中表達K.vulgareWSH-001來源的SDH、SNDH和PQQ，一步法從山梨醇生產(chǎn)2-酬基-k古龍酸（2-ketoA-gulonicacid,2-KLG)。同年，天津元英進等在Ketogulonigeniumvulgare中同時表達山梨糖脫氨酶、山梨酬糖脫氨酶W及輔酶PQQ，從山梨糖出發(fā)生產(chǎn)2-KLG(Met油olicElngineering2013,19,50-56)?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0005]本發(fā)明針對現(xiàn)有5-KGA產(chǎn)量低的問題，提供了一株高產(chǎn)5-KGA的氧化葡萄糖桿菌基因工程菌及其制備方法和應(yīng)用，[0006]一株高產(chǎn)5-KGA的氧化葡萄糖桿菌基因工程菌的制備方法，包括如下步驟：[0007](1)將GA2DH基因和PDC基因（丙酬酸脫簇酶（pyruvatedecarbo巧lase,)基因）的上、下游片段分別引入重組整合型自殺質(zhì)粒pJKM的多克隆位點，分別得到GA2DH基因的自殺型敲除質(zhì)粒PAG0X1231和PDC基因的自殺型敲除質(zhì)粒PAG0X1081;所述重組整合型自殺質(zhì)粒帶有SacB基因、抗生素標(biāo)記和多克隆位點；[0008](2)將所得自殺型敲除質(zhì)粒PAG0X1231電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入宿主菌中，依次經(jīng)抗生素抗性篩選、無抗培養(yǎng)和薦糖篩選，然后通過菌落PCR獲取GA2DH基因敲除的陽性突變子，命名為G.oxydansZJU1；[0009](3)將所得自殺型敲除質(zhì)粒PAG0X1081電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入經(jīng)傳代后的G.oxydansZJU1中，依次經(jīng)抗生素抗性篩選、無抗培養(yǎng)和薦糖篩選，然后通過菌落PCR獲取PDC基因敲除的陽性突變子，即得氧化葡萄糖酸桿菌基因工程菌，命名為G.oxydansZJU2;[0010](4)將31(148、口9948〔06、11曲、口。169及細胞色素6〇3氧化酶〇7〇84〔0基因轉(zhuǎn)入步驟(3)所得氧化葡萄糖酸桿菌基因工程菌G.oxydansZJU2中即得。W11]本發(fā)明在宿主中過表達膜結(jié)合山梨醇脫氨酶sldAB基因，W及融合表達輔酶PQQ基因簇和末端電子受體細胞色素b〇3氧化酶?；诨驘o痕體系制備得到基因工程菌G.oxydansZJU2,通過控制抑、溶氧，在補料發(fā)酵的條件下，5-KGA產(chǎn)量達102g/l，平均生成速率為1.7g/L?h。然而，5-KGA生物合成的產(chǎn)量相對還是比較低，無法滿足工業(yè)化應(yīng)用的要求，比如5-KGA用來催化制備k(+)-酒石酸。為進一步提高5-KGA的產(chǎn)量，本發(fā)明在G.oxydansZJU2基礎(chǔ)上，通過基因工程手段構(gòu)建一株過表達sldAB基因，并同時融合表達輔酶PQQ及末端電子受體細胞色素b〇3氧化酶的工程菌，其能高效轉(zhuǎn)化葡萄糖為5-KGA。采用輔酶和呼吸鏈代謝工程的同時改造在氧化葡萄糖酸桿菌中生產(chǎn)5-KGA在國內(nèi)未見報道。[0012]G.oxydansZJU1經(jīng)過傳代后，自殺質(zhì)粒將自動消除，不影響下一步基因的修飾。[0013]所述SacB基因的堿基序列如SEQIDNO.1所示。[0014]優(yōu)選地，所述抗生素標(biāo)記為卡拉霉素抗性基因標(biāo)記。[0015]優(yōu)選地重組整合型自殺質(zhì)粒的制備方法如下：[0016](1)構(gòu)建含SacB基因的克隆質(zhì)粒pEASY-Blunt-SacB;[0017]似取測序正確的克隆質(zhì)粒pEASY-Blunt-SacB，通過SspI單酶切克隆質(zhì)粒pEASY-Blunt-SacB和自殺質(zhì)粒地ISmobGII，回收并連接、轉(zhuǎn)化進E.coliD冊a，篩選獲取SacB連接方向正確的陽性克隆，并培養(yǎng)E.coliD冊a，提取整合型質(zhì)粒，即得所述重組整合型自殺質(zhì)粒pJKM。[0018]本發(fā)明所采用的自殺質(zhì)粒地ISmobGII構(gòu)建方法可參見文獻化wmobiliz油levectorsuitableforgenereplacementinGram-neg曰tiveb曰cteri曰曰ndtheiruseinmappingofthe3'endoftheXanthomonascampestrispv.Campestrisgumoperon.ApplEnvironMicrobiol1999,65:278-282,本發(fā)明中由該質(zhì)粒的構(gòu)建者（IELPI，L.InstitutedeInvestigacionesMtOqUl'micasFundacio'nCampomar,FacultaddeCienciasExactasyNaturales,UBA,andCONICET,1405BuenosAires,Argentina,Phone:54(1)863-4011/19.Fax:54(1)865-2246.E-mai1:LIELPIOiib.uba.ar.)提供。從自殺質(zhì)粒地ISmobGII出發(fā)，構(gòu)建新型含有SacB基因的整合型自殺質(zhì)粒pJKM，應(yīng)用于葡萄糖酸桿菌的基因無痕操作。SacB基因編碼一個可W分泌的果聚糖薦糖酶，其能水解薦糖形成高分子量的果聚糖，使得革蘭氏陰性菌在含有5-10%的薦糖培養(yǎng)基上出現(xiàn)致死表型，W此作為反向篩選標(biāo)記，操作安全，無毒。[0019]構(gòu)建含SacB基因的重組質(zhì)粒祀ASY-Blunt-SacB的方法如下：[0020](1)W如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的堿基序列為引物擴增SacB基因；[0021]上游引物：5，-AATATTcacatatacctgccgttcac當(dāng)前第1頁1 2 3 4