一種綿羊低氧適應性的快速篩選方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及利用分子標記預測綿羊低氧適應性，并用于引種 和育種的分子標記輔助選擇方法。
【背景技術】
[0002] 在我國面積最大的青藏高原牧區(qū)約有20億畝可利用的高寒草場，其中綿羊業(yè)是 當?shù)匦竽翗I(yè)的主要部門。目前，青藏高原的大部分綿羊為藏系綿羊，生長速度慢、產(chǎn)肉性能 極低、繁殖力弱。而高原特有的高寒低氧環(huán)境造成引進的優(yōu)良品種或者引進品種與當?shù)仄?種的雜交后代很難適應高寒低氧環(huán)境。找到一種合適的方法，篩選適應高原低氧環(huán)境的綿 羊品種或者雜交個體，將大大提高引種和進一步雜交選育的效率。
[0003] 在高原適應的各種因素中，血紅蛋白（Hemoglobin,HB)在動物體內擔負著運送 氧氣和二氧化碳的重要生理功能，與高原動物的低氧適應性直接相關。1955年Harris和 Warren用紙層析電泳測定出綿羊HB存在HBA和HBB兩種變異體，他們把pH5. 6時向陽極 泳動得快的HB區(qū)帶稱為HBA，把泳動得慢者稱為HBB(HARRISandWARREN1955)。從表 型上，Dawson等（DAWSONandEVANS1967)進行的綿羊低氧耐力試驗，證明具有HBA的綿 羊具比有HBB的綿羊具有更強的低氧耐受力。群體調查也顯示英國山地綿羊以HBA占優(yōu) 勢，低地綿羊以HBB為顯著，前者對高海拔和低營養(yǎng)的飼料有較好的適應性（MANWELLand BAKER1970)。HBA低氧適應的機理是其具有更高的氧親和力，這在包括藏羊的多個綿羊品種 中都已經(jīng)被證明（HUISMANandKITCHENS1968;VANVLIETandHUISMAN1964 ;周虞爛and 劉國富1985)。在我國藏綿羊群體基因組研究中發(fā)現(xiàn)，歐拉型藏綿羊HB的HBA基因型為優(yōu) 勢基因型，是對高原缺氧環(huán)境的適應（信金偉etal. 2007)。藏羊的HBA基因頻率會隨著 海拔高度上升發(fā)生敏銳而有規(guī)律變化（張才駿etal. 1993 ;張才駿etal. 1988 ;張才駿et al. 1987)。以上研究結果都證明了HBA和高原低氧適應性直接相關，高頻率的HBA也是藏 羊能在其他品種綿羊不能適應與生存的高海拔地區(qū)健康生息和繁衍后代的重要原因之一。
[0004] 因為上述綿羊血紅蛋白多態(tài)性對高原低氧適應性的關系，通過選育提高種群的 HBA基因頻率，是青藏高原藏綿羊育種的重要方向。然而從1955年至今為止，區(qū)分綿羊HBB 和HBA的蛋白的方法并無實質改進，仍是利用蛋白質多肽鏈的氨基酸組成的微細差異，在 電泳模式上表現(xiàn)出差別。如紙層析或聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳（PAGE)。蛋白樣品的提 取，保存和電泳均需要較高的條件。另外，蛋白鑒定需要的樣品量較大，該方法僅可在羊出 生后再鑒別血紅蛋白類型。目前體外受精和胚胎移植技術已經(jīng)非常成熟并已經(jīng)廣泛應用于 新品種的引種和繁殖。然而受體羊的選擇、超數(shù)排卵、孕期管理和生產(chǎn)都有較高的經(jīng)濟和時 間成本。出生后再鑒定，拋棄基因型不合適的羊羔，會造成很大的浪費。以上原因導致目前 基于蛋白電泳的檢測方法對樣品、技術、成本的要求都很高。
[0005] DNA的提取、保存和電泳均易于蛋白質，目前對HBA和HBB在基因組上的的結構差 異已經(jīng)研究清楚。HBA和HBB在基因組上的差異是由兩種不同的單倍型（A型和B型）造成 的。A單倍型由0血紅蛋白家族的12個同源基因或假基因組成，B單倍型只包括其中的八 個基因或假基因，尤其是B單倍型中不包括Pe基因。所以從結構上，B單倍型相對與A單 倍型有四個基因長度約30kb的缺失，從功能上，0 ￡基因轉錄產(chǎn)物的氧親和力較高，造成含 有0￡的單倍型低氧耐受力強（Garner&Lingrel1988)。
[0006] 雖然HBA和HBB基因結構和功能的關系已經(jīng)被廣泛的接受，然而目前分子生物學 上對大片段插入/缺失的檢測缺乏有效手段。理論上可用的檢測方法有：全基因組測序、 Southern印記雜交、免疫熒光原位雜交（FISH)還有近年來發(fā)展的長片段PCR技術和多重連 接探針擴增技術（MLAP)。這些檢測方法對樣品、技術設備、實驗成本的需要甚至高于蛋白 電泳，所以僅限于實驗研究，并未在生產(chǎn)中被用于HB分型。另外直接通過該基因簇中基因 序列（如Pe)的差異檢測HBA也比較困難，原因是該區(qū)域是由多個高同源性的基因家族組 成的基因簇，很難設計出特異引物。同時，目前也并無與HBA連鎖的分子標記及其應用的報 道。

【發(fā)明內容】

[0007] 針對通過蛋白電泳對綿羊HB分型要求樣品量大、技術困難、成本高的不足，本發(fā) 明提供一種基于基因組多態(tài)性的綿羊低氧適應性的快速篩選方法及其應用，從而提高綿羊 高原低氧適應性的預測速度，加快輔助引種和育種過程。
[0008] 為達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案：
[0009] 一種綿羊低氧適應性的快速篩選方法，包括以下步驟：
[0010] 1)提取被檢測綿羊的基因組DNA;
[0011] 2)根據(jù)存在于綿羊參考基因組3. 1版本中15號染色體上47. 52~47. 56Mb區(qū)域 的序列多態(tài)性，對所述基因組DNA進行基因分型；在所述區(qū)域，存在A型和B型兩種單倍型， B型相對于A型存在片段缺失；或者，根據(jù)定位于所述區(qū)域內的分子標記位點或根據(jù)定位于 所述區(qū)域兩側的緊密連鎖的分子標記位點，對所述基因組DNA進行基因分型。
[0012] 根據(jù)基因分型結果，對具有A型序列特征的被測綿羊或者根據(jù)分子標記位點的單 倍型預測具有A型序列特征的被測綿羊進行血紅蛋白分型檢測，從而篩選出低氧適應性較 高的綿羊個體。
[0013] 所述A型的序列長度為70356bp，B型的序列長度為40001bp。所述A型的序列 如SEQ.ID.NO. 1所示，B型的序列如綿羊參考基因組3. 1版本中15號染色體上47. 52~ 47. 56Mb區(qū)域的序列所示。所述分子標記位點定位于所述區(qū)域兩側47. 50~47. 52Mb以及 47. 56~47. 59Mb的區(qū)域內。
[0014] 所述分子標記位點為SNP位點。
[0015] 上述綿羊低氧適應性的快速篩選方法在低氧適應性綿羊輔助引種、雜交選育中的 應用。上述綿羊低氧適應性的快速篩選方法在高原適應性綿羊引種和品種選育中的應用。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是：
[0017] 本發(fā)明主要利用非編碼區(qū)及基因間區(qū)中的多態(tài)性位點對血紅蛋白類型進行預測， 與編碼區(qū)序列相比，基因間區(qū)所受的選擇壓力較低，序列多態(tài)性較高，同源性較小，容易設 計出特異引物或探針。
[0018] 本發(fā)明提供的A型序列（參見SEQ.ID.NO. 1)與B型相比，除B型具有約30kb缺 失之外，在同源區(qū)與B型之間的差異高達13%。且該遺傳標記序列絕大部分位于基因間區(qū)， 與其他基因家族成員保守性較小，容易設計出特異性引物和探針區(qū)分。利用該多態(tài)性區(qū)域 及周圍緊密連鎖的分子標記為點，例如SNP位點，可以用簡便基因分型方法預測綿羊血紅 蛋白類型。經(jīng)過實測，本發(fā)明提供的單個分子標記預測準確率均達到80 %以上。
[0019] 另外，因為DNA的提取、保存和電泳均易于蛋白質，本發(fā)明僅需少量甚至單細胞樣 品就能進行檢測，可以應用于胚胎植入前階段的基因型篩查，快速選出HBA型的胚胎進行 移植。與出生后再進行檢測，拋棄羊羔相比，節(jié)約了時間和經(jīng)濟成本。同時無需對所有綿羊 個體一一進行蛋白電泳分型，也可用于快速篩選低氧適應性較強的HBA成年綿羊品種或個 體，有利于加快高原綿羊的引種和育種。
【具體實施方式】
[0020] 下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明，但不應理解為對本發(fā)明的限制。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明提供的血紅蛋白P基因簇的A型長單倍型特異序