用于實時熒光定量pcr方法監(jiān)測鏈狀亞歷山大藻細胞爆發(fā)性生長的引物組及監(jiān)測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】 [0001] 的
[0002] 本發(fā)明涉及基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于實時熒光定量PCR方法監(jiān)測鏈 狀亞歷山大藻細胞爆發(fā)性生長的引物組及監(jiān)測方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 赤潮作為一種生態(tài)現(xiàn)象，由于對環(huán)境、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、漁業(yè)、旅游業(yè)和人類健康的嚴(yán) 重影響而受到廣泛重視，赤潮已成為全球環(huán)境問題熱點之一。近十幾年來，由于海洋污染日 益加劇，我國赤潮災(zāi)害也有加重的趨勢，由分散的少數(shù)海域，發(fā)展到成片海域，一些重要的 養(yǎng)殖基地受害尤重。
[0004] 2000年我國海域共記錄到赤潮28起，比1999年增加了 13起，累計面積1萬多平 方公里。其中，東海發(fā)現(xiàn)11起，累計面積達7800多平方公里；渤海發(fā)現(xiàn)7起，累計面積近 2000平方公里，黃海發(fā)現(xiàn)4起，累計面積800多平方公里；南海發(fā)現(xiàn)6起，但累計面積不到 50平方公里。
[0005] 2003年，全海域共發(fā)生100平方公里以上的赤潮27次。其中，500平方公里以上 的赤潮8次，東海赤潮發(fā)生次數(shù)和累計面積分別約占全海域的72%和89%。
[0006] 2006年，全海域赤潮發(fā)生次數(shù)較上年增加，全年共發(fā)現(xiàn)赤潮93次，較2005年增加 約13% ;赤潮累計發(fā)生面積約19840平方公里，較2005年減少約27%。其中，在赤潮監(jiān)控 區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)赤潮46次，累計面積約11590平方公里，分別約占全海域赤潮累計發(fā)生次數(shù)和面 積的49%和58%。全海域共發(fā)生100平方公里以上的赤潮31次，累計面積18540平方公 里，分別占赤潮發(fā)生次數(shù)和累計面積的33%和93% ;其中，面積超過1000平方公里的赤潮 為7次，較上年減少2次，累計面積減少51 %。赤潮高發(fā)區(qū)集中在東海海域，赤潮發(fā)生次數(shù) 和累計發(fā)生面積分別占全海域的68%和76%。
[0007] 為將赤潮危害降至最低，赤潮的監(jiān)測預(yù)報必不可少，除了海洋物理學(xué)耗資巨大的 衛(wèi)星遙感與飛行監(jiān)測，生物學(xué)的監(jiān)測方法主要有依賴形態(tài)學(xué)檢測的光學(xué)顯微鏡觀察和圖像 識別系統(tǒng)、免疫學(xué)及核酸、lectin探針檢測技術(shù)等。這些方法主要是通過赤潮藻細胞數(shù)目 的增減判斷赤潮爆發(fā)的可能性，而一旦細胞達到一定的數(shù)目，赤潮已經(jīng)發(fā)生，即實際上達不 到預(yù)報的目的，真正的預(yù)報應(yīng)可以"推測"赤潮未來發(fā)生的可能性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種用于實時熒光定量PCR 方法監(jiān)測鏈狀亞歷山大藻細胞爆發(fā)性生長的引物組及監(jiān)測方法。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0010] -種用于實時熒光定量PCR方法監(jiān)測鏈狀亞歷山大藻細胞爆發(fā)性生長的引物，所 述引物的序列如MT-Q-S和MT-Q-A所示。
[0011] 一種使用實時熒光定量PCR方法監(jiān)測鏈狀亞歷山大藻細胞爆發(fā)性生長的方法，使 用熒光定量PCR分析mt基因差異表達，以cob和18SRNA為內(nèi)參基因，以雙內(nèi)參基因的Ct值來校準(zhǔn)目的基因mt相對表達量，采用2AACT法進行數(shù)據(jù)的分析，AACT=(CT^t-CT內(nèi)參基 因）實驗-(CTnit-CT內(nèi)參綱）對照；當(dāng)2 aact^ 2時，鏈狀亞歷山大藻細胞將進入爆發(fā)性生長 狀態(tài)；當(dāng)2 AACT< 2時，鏈狀亞歷山大藻細胞未進入爆發(fā)性生長狀態(tài)。
[0012] 所述內(nèi)參基因為：cob和18SRNA。
[0013] 所述內(nèi)參基因的引物為：
[0014] cob-S：TTTTCTTCAAACTCATTTCGGGAT；
[0015] cob-A：TGGGCACAGCTTTTAACATAGCATA；
[0016] 18SrRNA-S：GGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGA；
[0017] 18SrRNA-A：CAAATCACTCCACCAACTAAGAACGG〇
[0018] -種使用實時熒光定量PCR方法監(jiān)測鏈狀亞歷山大藻細胞爆發(fā)性生長的方法，具 體步驟如下：
[0019] (1)采用濾膜過濾法從目標(biāo)海域收集鏈狀亞歷山大藻IO3~10 6個，將收集的藻細 胞置于3L三角瓶的2L海水中，遮光布黑暗48小時進行同步化處理，每隔2小時晃動一次， 然后進行實驗室培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20±1°C，光照強度30001x，光暗周期12h光照/12h黑 暗，培養(yǎng)基為檢測海域過濾消毒海水，培養(yǎng)至第二天為生長周期的延遲期，作為對照組；實 驗組為繼續(xù)在海域中生長的藻細胞；采用濾膜過濾法分別從對照組和實驗組收集藻細胞， 分別作為對照組和實驗組，進行實驗測定。
[0020] ⑵RNA提??；
[0021] (3)反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA:
[0022] (4)qPCR：
[0023] 利用對照組與實驗組的反轉(zhuǎn)錄cDNA，進行qPCR反應(yīng)；
[0024] qPCR反應(yīng)體系如下：
[0025]
[0027] 熒光實時定量PCR的反應(yīng)條件如下：
[0028] 第一步，5(TC，2min;
[0029] 第二步，95°C，2min;
[0030] 第三步，95°C，15sec;60°C，Imin;40 個循環(huán)；
[0031] 第四步，做熔解曲線：95°C，15sec;60°C，Imin;95°C，15sec;60°C，15sec;
[0032]熒光信號的采集設(shè)置在第三步后；收集每個重復(fù)的mt基因Ct值，內(nèi)參基因的Ct 值，兩個內(nèi)參基因Ct值取幾何平均值；
[0033] (5)基因相對表達量分析
[0034] 采用2AACT的相對定量方法對基因的相對表達量進行分析；AACT=(CT^t-CT內(nèi) 參基因）實驗-(CTnit-CT內(nèi)參綱）對照；
[0035] 2aactS2,鏈狀亞歷山大藻細胞將進入爆發(fā)性生長狀態(tài)；
[0036] 當(dāng)2AACT < 2時，鏈狀亞歷山大藻細胞未進入爆發(fā)性生長狀態(tài)。
[0037] 本發(fā)明的優(yōu)勢在于：1、靈敏度高、特異性和可靠性強。在藻細胞生長的對數(shù)期即能 夠完成檢測，可在鏈狀亞歷山大藻細胞富集量最大之前采取措施，減少危害，實現(xiàn)對赤潮真 正的預(yù)警預(yù)報。2、自動化程度高，無污染。整個實驗過程在實驗室進行，沒有外排污染物。 3、具有實時和準(zhǔn)確的特點。能夠從分子水平檢測鏈狀亞歷山大藻細胞的生長階段，以小見 大，從最大程度上減少了赤潮預(yù)測的誤差性。4、費用較低。實驗過程是基于ABI7500熒光 定量PCR儀，沒有露天大規(guī)模設(shè)施，降低了實驗經(jīng)費。5、實驗操作簡單，具有可推廣性。
【具體實施方式】
[0038] 本發(fā)明實施例中未注明具體條件的實驗方法，通?？砂闯Ｒ?guī)條件，如J.薩姆布魯 克（Sambrook)等編寫的《分子克隆實驗指南》中所述的條件來進行操作。
[0039] mt基因在我們檢測的所有爆發(fā)性生長條件下均表現(xiàn)表達量升高，表明其與細胞生 長的相關(guān)性和一致性。cob和18SrRNA是廣泛用于熒光定量PCR的內(nèi)參基因，并且同時使 用兩個內(nèi)參基因在一定程度上消除了由于內(nèi)參基因不穩(wěn)定所造成的誤差。
[0040] 使用Primer5. 0對引物進行設(shè)計，引物設(shè)計遵守以下原則：引物設(shè)計原則：產(chǎn)物 長度75bp-200bp，避免二級結(jié)構(gòu)，GC含量45 % -55 %，引物長度20-25bp，Tm值在58-62 °C。 引物由北京六合華大基因科技股份有限公司進行合成。
[0041] 實施例1
[0042] (1)實驗材料的培養(yǎng)與收集：
[0043] 將生長在中氮中磷培養(yǎng)基中的鏈狀亞歷山大藻藻細胞在黑暗條件下進行同步化 處理48小時，然后將藻細胞接種到2L新的特定的四種濃度的f/2培養(yǎng)基中（表1)進行培 養(yǎng)，初始濃度為200〇cells/mL。光照強度30001x，培養(yǎng)溫度20± 1°C，光暗周期為12h光照 /12h黑暗。采用濾膜過濾法分別從對照組和實驗組收集藻細胞IO3~10 6個，分別作為對 照組和實驗組，進行實驗測定。對照組為中氮中磷條件下生長至第二天的藻細胞，實驗組為 中氮中磷，高氮高磷，高氮和高磷條件下生長至第12天藻細胞。四種培養(yǎng)基濃度見表1，除 所示成分濃度外，其它與f/2培養(yǎng)基濃度一致。
[0044] 表1四種培養(yǎng)基濃度
[0045]
[0046] (2)RNA的提取
[0047] 用Trizol(TaKaRa)手提法對對照組和實驗組藻細胞的總RNA進行提取，操作依據(jù) 說明書的指示進行：
[0048] 1)取出于-