中I為樣品墊，2為連接墊(此處用堿性磷酸酶處理)，3為纖維膜，4為吸附墊，5為檢測線(使用特異性探針處理)，6為控制線(使用通用探針處理)。
[0030]圖2為試紙條檢測結(jié)果顯示示意圖。其中，當(dāng)檢測線和控制線處均有條帶時(shí)為陽性(如圖2的左圖)，當(dāng)只有控制線有色時(shí)為陰性(如圖2的右圖)。
【具體實(shí)施方式】
[0031]以下結(jié)合非限制性的具體實(shí)施例來對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明。
[0032]實(shí)施例中的核酸探針及引物均購于上海生工生物。
[0033]實(shí)施例1:人乳頭瘤病毒(HPV)核酸的檢測
[0034]1.HPV通用引物及探針的設(shè)計(jì)采購。均購于上海生工生物。
[0035]2.核酸試紙條的制備:如圖1所示，在連接墊處使用堿性磷酸酶處理，然后在檢測線處使用與目的產(chǎn)物能特異性雜交的探針進(jìn)行處理；在控制線處使用通用探針，該通用探針被設(shè)計(jì)為與擴(kuò)增待檢測目的核酸的PCR所用的上游引物反向互補(bǔ)。
[0036]3.HPV核酸樣本的提取:所述HPV核酸樣本是從江蘇省某醫(yī)院HPV患者的宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本提取的。用核酸提取試劑盒進(jìn)行提取，主要利用煮沸裂解法進(jìn)行核算的提取。
[0037]4.PCR擴(kuò)增:根據(jù)步驟2和3中的試劑及核酸樣本進(jìn)行PCR體系配制，共20ul體系，包括19ul的PCR反應(yīng)液和Iul的模板。其中，上游引物上標(biāo)記有生物素。按照如下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增:
[0038]50 °C 2min, 94°C 4min ；
[0039]94°C 30sec, 60°C 45sec, 72°C 20sec, 35 cycles ；
[0040]4°C hold.
[0041]擴(kuò)增完成后保存待用。
[0042]5.提前對(duì)步驟2中的核酸試紙條進(jìn)行恒溫處理，溫度為40攝氏度。
[0043]6.向步驟4中的擴(kuò)增產(chǎn)物加入擴(kuò)展液及顯示底物，混勻后向試紙條樣品墊上滴加1ul，反應(yīng)15分鐘后觀察結(jié)果。
[0044]7.根據(jù)試紙條上檢測線，控制線的顯色情況，具體顯色情況如圖2:當(dāng)控制線和檢測線都顯色時(shí)，檢測結(jié)果為陽性；當(dāng)只有控制線顯色時(shí)，檢測結(jié)果為陰性；當(dāng)控制線不顯色時(shí)，實(shí)驗(yàn)過程有問題，需重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0045]應(yīng)當(dāng)注意的是，以上所述的實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。通過參照典型實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但應(yīng)當(dāng)理解為其中所用的詞語為描述性和解釋性詞匯，而不是限定性詞匯?？梢园匆?guī)定在本發(fā)明權(quán)利要求的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明作出修改，以及在不背離本發(fā)明的范圍和精神內(nèi)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修訂。盡管其中描述的本發(fā)明涉及特定的方法、材料和實(shí)施例，但是并不意味著本發(fā)明限于其中公開的特定例，相反，本發(fā)明可擴(kuò)展至其他所有具有相同功能的方法和應(yīng)用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種核酸檢測試紙條，其依次包括樣品墊、連接墊、纖維膜和吸附墊，纖維膜上依次設(shè)置有檢測線和控制線，其特征在于，所述連接墊上結(jié)合有堿性磷酸酶，所述檢測線上結(jié)合有能與待檢測的目的核酸雜交的特異性探針，所述控制線上結(jié)合有通用探針，并且所述通用探針與擴(kuò)增待檢測目的核酸的PCR所用的上游引物和/或下游引物反向互補(bǔ)。2.—種核酸檢測試劑盒，所述試劑盒包括根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸檢測試紙條，以及顯色底物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述顯色底物為3-氨基-9-乙基咔唑。4.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸檢測試紙條的方法，其包括如下步驟: 1)制備依次包括樣品墊、連接墊、纖維膜和吸附墊，纖維膜上依次設(shè)置有檢測線和控制線的試紙條； 2)在連接墊處用堿性磷酸酶處理； 3)在檢測線處用與待檢測的目的核酸雜交的特異性探針處理； 4)在控制線處用與擴(kuò)增待檢測目的核酸的PCR所用的上游引物和/或下游引物反向互補(bǔ)的通用探針處理。5.一種用核酸試紙條來檢測核酸的方法，包括如下步驟: 1)根據(jù)待檢測的目的核酸制備與待檢測的目的核酸雜交的特異性探針，并由此制備根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸檢測試紙條或者根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的核酸檢測試劑盒； 2)提取并用被生物素標(biāo)記的上游引物和/或下游引物通過PCR來擴(kuò)增待檢測的目的核酸，得到擴(kuò)增產(chǎn)物； 3)對(duì)試紙條在20-60攝氏度、優(yōu)選38-42攝氏度下進(jìn)行提前溫育10分鐘以上，然后向步驟2)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入擴(kuò)展液和顯色底物并混勻，向步驟I)制備得到的核酸檢測試紙條或者核酸檢測試劑盒中的核酸檢測試紙條的樣品墊上滴加1-100微升，優(yōu)選為5-20微升，更優(yōu)選為8-12微升混勻后的混合物，再在40攝氏度下溫育5-60分鐘、優(yōu)選10-30分鐘、更優(yōu)選13-17分鐘，觀察結(jié)果，或者 向步驟2)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入擴(kuò)展液和顯色底物并混勻，在向步驟I)制備得到的核酸檢測試紙條或者核酸檢測試劑盒中的核酸檢測試紙條的樣品墊上滴加1-100微升，優(yōu)選為5-20微升，更優(yōu)選為8-12微升混勻后的混合物的同時(shí)在38-42攝氏度下溫育5_60分鐘、優(yōu)選10-30分鐘、更優(yōu)選10-15分鐘，觀察結(jié)果。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，在步驟I)中，在根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸檢測試紙條或者根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的核酸檢測試劑盒中，通用探針與擴(kuò)增待檢測目的核酸的PCR所用的上游引物反向互補(bǔ)， 并且，在步驟2)中，上游引物被生物素標(biāo)記。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，在步驟I)中，在根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸檢測試紙條或者根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的核酸檢測試劑盒中，通用探針與擴(kuò)增待檢測目的核酸的PCR所用的下游引物反向互補(bǔ)， 并且，在步驟2)中，下游引物被生物素標(biāo)記。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種核酸檢測試紙條，其依次包括樣品墊、連接墊、纖維膜和吸附墊，纖維膜上依次設(shè)置有檢測線和控制線，其特征在于，所述連接墊上結(jié)合有堿性磷酸酶，所述檢測線上結(jié)合有能與待檢測的目的核酸雜交的特異性探針，所述控制線上結(jié)合有通用探針，并且所述通用探針被生物素標(biāo)記與擴(kuò)增待檢測目的核酸的PCR所用的上游引物和/或下游引物反向互補(bǔ)。本發(fā)明還涉及包括所述試紙條的試劑盒、所述試紙條的制備方法，以及一種檢測方法。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105002282
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510456919
【發(fā)明人】劉澤濤, 楊華衛(wèi)
【申請(qǐng)人】江蘇獵陣生物科技有限公司
【公開日】2015年10月28日
【申請(qǐng)日】2015年7月29日