基于miR1511的大豆分子標(biāo)記iSIndel及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中基于miR1511的大豆分子標(biāo)記iSIndel及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] microRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度為19_24nt的非編碼RNA，miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平通過 與mRNAs的序列互補(bǔ)識(shí)別靶基因，并引起靶基因的降解或抑制其翻譯，最終達(dá)到抑制特定基 因表達(dá)的目的（BartelDP.MicroRNAs:targetrecognitionandregulatoryfunctions. Cell, 2009, 136(2) :215 - 233.)。近年來大量研究表明，miRNA參與調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育、應(yīng)答 生物及非生物脅迫和物種進(jìn)化等許多重要生物學(xué)過程（BushatiN,CohenSM.MicroRNA functions.AnnualReviewofCellandDevelopmentalBiology, 2007, 23:175-205.)〇因 此miRNA研究對(duì)于提尚植物的廣量和品質(zhì)有重要的意義。
[0003]近年，YijieGui等（GuiYetal.，iSNAP:asmallRNA-basedmolecular markertechnique.PlantBreeding, 2011，130(5) :515-520.)以煙草和水稻為材料開 發(fā)了一種基于小RNA序列的分子標(biāo)記iSNAP，為分子標(biāo)記輔助育種提供了一種新手段。 PangMingxiong等(PangMetal. ,ComparativeexpressionofmiRNAgenesand miRNA-basedAFLPmarkeranalysisincultivatedtetraploidcottons.Journalof PlantPhysiology, 2011, 168:824-830.)以棉花為材料開發(fā)了一種基于miRNA的AFLP分 子標(biāo)記。XuemeiChen等（ChenXetal. ,Linkagemappingandexpressionanalysis ofmiRNAsandtheirtargetgenesduringfiberdevelopmentincotton.BMC Genomics, 2013, 14:706.)以棉花為材料開發(fā)了基于miRNA的SRAP標(biāo)記（Sequence-Related AmplifiedPolymorphism)。miRNA這類內(nèi)源單鏈非編碼小分子RNA，在真核生物體中 廣泛存在(BartelDP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanisms,andfunction. Cell，2004，116:281-297.)。申請(qǐng)人通過5 'RACE-PCR技術(shù)驗(yàn)證了miR1511的靶基因?yàn)?Gmrpl4a，Gmrpl4a屬于60S核糖體蛋白L4家族（RPL4)，核糖體蛋白是核糖體亞基的關(guān)鍵成 分，它們最為熟知的功能是組裝核糖體和蛋白質(zhì)合成。大量研究表明，在動(dòng)植物中一些核 糖體蛋白還有多種與核糖體無關(guān)的生物學(xué)功能，如細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、發(fā)育、凋亡和逆境調(diào) 節(jié)等方面（Luoetal. ,MiR1511c〇-regulateswithmiR1511*tocleavetheGmRPL4agene insoybean.ChineseScienceBulletin, 2012 (57)3804-3810)〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何鑒定一年生野生大豆（GlycinesojaSieb.et Zucc.)原生境，及如何鑒別栽培大豆（Glycinemax(L.)Merr.)和一年生野生大豆。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了大豆分子標(biāo)記或其多態(tài)性在鑒定或輔助 鑒定野生大豆原生境中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明所提供的大豆分子標(biāo)記或其多態(tài)性在鑒定或輔助鑒定野生大豆原生境中 的應(yīng)用中，所述大豆分子標(biāo)記（名稱為miR1511iSIndel)，是基于miR1511的大豆分子標(biāo) 記，miR1511iSIndel為以野生大豆的基因組DNA為模板，采用由與SEQIDNo. 1的第190 位上游特異結(jié)合的單鏈DNA和與SEQIDNo. 1的第386位下游特異結(jié)合的單鏈DNA組成的 引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增得到的DNA分子。
[0007]其中，SEQIDNo. 1 由 555 個(gè)核苷酸組成，SEQIDNo. 1 的第 243-263 位為miR1511 的對(duì)應(yīng)序列（即成熟miR1511的序列）。
[0008] 上述應(yīng)用中，所述miR1511iSIndel的多態(tài)性可為所述miR1511iSIndel對(duì)應(yīng)于 SEQIDNo. 1 的第 190-386 位為下述Al)、A2)或A3):
[0009]Al) SEQIDNo. 1 的第 190-386 位；
[0010]A2) SEQID No. 2 的第 190-314 位；
[0011]A3) SEQIDNo. 3 的第 190-239 位。
[0012] 其中，SEQIDNo. 2和SEQIDNo. 3所示的DNA序列均不含miR1511的對(duì)應(yīng)序列 (即成熟miR1511的序列）。
[0013] 上述應(yīng)用中，所述miR1511iSIndel的多態(tài)性可為所述miR1511iSIndel對(duì)應(yīng)于 SEQIDNo. 1 為SEQIDNo. 1、SEQIDNo. 2 或SEQIDNo. 3。
[0014] 上述應(yīng)用中，所述應(yīng)用可包括如下BI)或B2):
[0015]BI)以待測(cè)野生大豆的基因組DNA為模板，采用所述引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增 產(chǎn)物，根據(jù)所述擴(kuò)增產(chǎn)物的序列按照下述方法鑒別所述待測(cè)野生大豆的原生境：所述擴(kuò)增 產(chǎn)物的序列含有所述Al)，所述待測(cè)野生大豆的原生境為或候選為中國(guó)或其周邊鄰國(guó)（東 經(jīng)97.29° -132.3°、北煒23.57° -51.43° );所述擴(kuò)增產(chǎn)物的序列含有所述A2)，所 述待測(cè)野生大豆的原生境為或候選為湖南省或湖北省（東經(jīng)109. 26° -111.50°、北煒 29.28° -31.52° );所述擴(kuò)增產(chǎn)物的序列含有所述A3)，所述待測(cè)野生大豆的原生境為或 候選為黃河中下游區(qū)域（東經(jīng)104. 41° -122.24°、北煒30. 12° -40.50° )或遼寧?。| 經(jīng) 119. 47。-122.43。、北煒 38. 54。-42.03。）；
[0016]B2)檢測(cè)野生大豆的總RNA中是否含有SEQIDNo. 4,如所述待測(cè)野生大豆的總 RNA含有SEQIDNo. 4所示的miR1511，所述待測(cè)野生大豆的原生境為或候選為全中國(guó)境 內(nèi)及周邊國(guó)家（東經(jīng)97. 29° -132. 3°、北煒23. 57° -51.43° );如所述待測(cè)野生大豆的 總RNA不含SEQIDNo. 4所示的miR1511，所述待測(cè)野生大豆的原生境為或候選為湖南省 或湖北?。|經(jīng)109. 26° -111.50°、北煒29. 28° -31.52° )或黃河中下游區(qū)域（東經(jīng) 104.41。-122.24。、北煒 30. 12。-40.50。）或遼寧?。|經(jīng) 119. 47。-122.43。、北煒 38.54° -42.03° )〇
[0017] 上述應(yīng)用中，所述檢測(cè)野生大豆的總RNA中是否含有SEQIDNo. 4可用核苷酸序 列為SEQIDNo. 5的探針進(jìn)行。
[0018] 上述應(yīng)用中，所述檢測(cè)野生大豆的總RNA中是否含有SEQIDNo. 4可利用 Northernblot進(jìn)行。
[0019] 上述應(yīng)用中，所述引物對(duì)可為由SEQIDNo. 1的第1-25位所示的單鏈DNA和與 SEQIDNo. 1的第532-555位反向互補(bǔ)的單鏈DNA組成的引物對(duì)。
[0020] 上述應(yīng)用中，所述擴(kuò)增可為PCR擴(kuò)增。
[0021] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述miR1511iSIndel。
[0022] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了檢測(cè)所述miR1511iSIndel的多態(tài)性的系 統(tǒng)。
[0023] 本發(fā)明所提供的檢測(cè)所述miR1511 iSIndel的多態(tài)性的系統(tǒng)，含有所述引物對(duì)。
[0024] 上述系統(tǒng)還可包括PCR所需的試劑和儀器。具體來說，所述系統(tǒng)可包括所述引物 對(duì)以及PCR所需要的其它試劑和儀器。
[0025]PCR所需要的其它試劑可包括DNA聚合酶和/或PCR緩沖液和/或dATP、dTTP、 dCTP和dGTP的dNTP的混合物和/或MgCl2。所述DNA聚合酶具體可為TaqDNA聚合酶。
[0026] 所述引物對(duì)和PCR所需要的其它試劑均可獨(dú)立包裝。所述引物對(duì)的兩條單鏈DNA 可獨(dú)立包裝。
[0027] 上述系統(tǒng)還可僅包括所述引物對(duì)。所述引物對(duì)的兩條單鏈DNA可獨(dú)立包裝。
[0028] 在實(shí)際應(yīng)用中，可將檢測(cè)miR1511 iSIndel多態(tài)性的系統(tǒng)與其它系統(tǒng)（如檢測(cè)其 它的大豆分子標(biāo)記多態(tài)性的系統(tǒng)）聯(lián)合在一起制備鑒定或輔助鑒定野生大豆原生境的產(chǎn) 品。
[0029] 其中，檢測(cè)miR1511iSIndel多態(tài)性的系統(tǒng)可為通過DNA測(cè)序、Northern blotting和/或Southernblotting確定miR1511iSIndel多態(tài)性所需的試劑和/或儀器。 利用DNA測(cè)序確定miR1511iSIndel多態(tài)性所需的試劑和/或儀器包括所述PCR引物對(duì)、進(jìn) 行PCR反應(yīng)所需試劑和儀器、進(jìn)行DNA測(cè)序所需試劑和儀器。利用Southernblotting確 定miR1511iSIndel多態(tài)性所需的試劑和/或儀器包括探針以及進(jìn)行Southernblotting 所需試劑和儀器。所述探針的序列可為與SEQIDNo. 1的第243-263位反向互補(bǔ)的序列， 如序列表中SEQIDNo. 5。所述探針可由T4多核苷酸激酶標(biāo)記。
[0030] 所述產(chǎn)品可為試劑或試劑盒，還可為由試劑或試劑盒與儀器組成的系統(tǒng)，如由引 物、PCR試劑、DNA測(cè)序試劑、PCR儀和/或DNA測(cè)序儀組成的系統(tǒng)或試劑盒，由包含引物、 PCR試劑、DNA測(cè)序試劑、PCR儀和/或DNA測(cè)序儀的系統(tǒng)或試劑盒與DNA測(cè)序所需要的其 他試劑組成的系統(tǒng)，由包含引物、PCR試劑、DNA測(cè)序試劑、PCR儀和/或DNA測(cè)序儀的系統(tǒng) 或試劑盒與提取基因組DNA所需要的試劑組成的系統(tǒng)，由探針、進(jìn)行Southernblotting的 系統(tǒng)或試劑盒與進(jìn)行Southernblotting所需其他試劑組成的系統(tǒng)，由探針、進(jìn)行Southern blotting的系統(tǒng)或試劑盒與提取RNA所需要的試劑組成的系統(tǒng)。
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