用于同時檢測五種牛病病毒的多重連接探針擴增檢測試劑盒及引物和探針的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供了一種用于檢測藍舌病、牛病毒性腹瀉、牛地方流行性白血病、牛傳染 性鼻氣管炎、口蹄疫病毒的多重連接探針擴增檢測試劑盒及引物和探針，可實現(xiàn)一次采樣， 一次分析，同時檢測5種牛病的目的，屬于檢驗檢疫領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 藍舌病病毒（BTV)、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV)、牛地方流行性白血病病毒（EBLV)、 牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV)、口蹄疫病毒（FMDV)是引起牛呼吸道疾病、繁殖障礙和消化 道疾病的主要常見病原，是危害養(yǎng)牛業(yè)最為嚴重的幾種病原，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE) 規(guī)定為跨界傳播病原，也是我國動物及動物產(chǎn)品國際貿(mào)易中重要的檢疫對象。
[0003] 目前，針對上述5種牛病病原建立了多種分子檢測技術(shù)，如PCR和熒光PCR技術(shù) 等，在這些疫病的診斷和防控中發(fā)揮了重要作用。但目前所建立的方法多是針對一種病原 的單目標檢測，在實際檢測中需要重復多次，才能完成檢測不同病原的目的，檢測工作量大 且時間長，不能滿足大批量動物檢疫快速通關(guān)的實際需要。且難以實現(xiàn)實際樣品中大量存 在的混合感染以及癥狀相似疫病的鑒別診斷。在建立單目標病原檢測技術(shù)的同時，各國獸 醫(yī)機構(gòu)也相繼研制了可同時檢測牛常見病毒的多重PCR及多重熒光PCR，但傳統(tǒng)PCR技術(shù)靈 敏度低、結(jié)果不易判定等缺點限制了其在多重檢測中的應(yīng)用，而熒光PCR由于不同探針采 用的焚光集團所發(fā)射的焚光存在相互干擾，且焚光PCR儀對不同波長焚光分辨的局限性也 限制了熒光PCR多重檢測技術(shù)的發(fā)展。
[0004] 本研究利用多重連接探針擴增技術(shù)（Multiplexligation-dependentprobe amplification，MLPA)在核酸檢測方面具有的特異、敏感，適合多重檢測等優(yōu)點，建立了 BTV、BVDV、EBLV、IBRV、FMDV五種牛病病原的MLPA檢測方法并組裝成試劑盒，在國內(nèi)外首次 實現(xiàn)一次采樣，一次分析，檢測5種重要牛病的目的，不僅減少了檢測的工作量和成本，且 能在最短的時間內(nèi)完成疫病的檢測，為疾病防制贏得時間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個目的是提供特異性強、靈敏度高的同時檢測藍舌病病毒（BTV)、牛 病毒性腹瀉病毒（BVDV)、牛地方流行性白血病病毒（EBLV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV) 和口蹄疫病毒（FMDV)的多重連接探針及一對通用引物。
[0006] 本發(fā)明的另一個目的是提供快速、準確、使用方便的同時檢測藍舌病病毒（BTV)、 牛病毒性腹瀉病毒（BVDV)、牛地方流行性白血病病毒（EBLV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒 (IBRV)和口蹄疫病毒（FMDV)的多重連接探針擴增檢測試劑盒。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0008] 在序列比對分析的基礎(chǔ)上，針對藍舌病病毒NS3基因、牛病毒性腹瀉病毒5'UTR基 因、牛地方流行性白血病病毒gP51基因、牛傳染性鼻氣管炎病毒gB基因、口蹄疫病毒3D基 因，分別設(shè)計一對長探針和短探針（序列見表1)，同時設(shè)計一對PCR擴增的通用引物（序 列見表2)。短探針由兩段核苷酸組成，一段是PCR擴增的通用引物，一段是病毒特異性序 列；長探針由三段核苷酸組成，除了PCR擴增的通用引物和病毒特異性序列外，在兩者之間 還加入特定大小的填充序列；且位于右側(cè)的探針5'端進行磷酸化處理。通過在上述5種病 毒的長探針中加入不同長度的填充序列，然后通過病毒模板變性、探針雜交、連接及通用引 物PCR擴增得到不同大小的PCR產(chǎn)物，通過毛細管電泳分析后實現(xiàn)對5種病毒的同時檢測。
[0009] 表1藍舌病病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛地方流行性白血病病毒、牛傳染性鼻氣管 炎病毒和口蹄疫病毒探針名稱和序列

[0012] 其中，上述SEQIDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:6,SEQIDNO:8和SEQIDNO: 10的5'端進行磷酸化處理；
[0013] 表2.通用引物序列
[0014]
[0015] 注：胞嘧啶（C)、鳥嘌呤（G)、腺嘌呤（A)、胸腺嘧啶（T)。
[0016] 我們采用多重連接探針擴增技術(shù)建立了同時檢測藍舌病病毒、牛病毒性腹瀉病 毒、牛地方流行性白血病病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒和口蹄疫病毒的檢測方法并組裝了 試劑盒。
[0017] 檢測藍舌病病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛地方流行性白血病病毒、牛傳染性鼻氣管 炎病毒和口蹄疫病毒的多重連接探針擴增檢測試劑盒，包括：
[0018] (I)MLPA緩沖液；
[0019] (2)探針，其包括檢測藍舌病病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛地方流行性白血病病毒、 牛傳染性鼻氣管炎病毒和口蹄疫病毒的長、短探針，所述探針的序列見表1，其中，所述SEQ IDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:6,SEQIDNO:8 和SEQIDNO: 10 的 5' 端進行了磷酸 化處理；本發(fā)明的一個實施方案中，每種探針的濃度為lyM，使用時各取0.8yL，加水至終 體積600yL，配制成探針混合物；
[0020] (3)連接反應(yīng)液，其包括：Ligase-65緩沖液A和Ligase-65緩沖液B，在本發(fā)明的 一個實施方案中，連接反應(yīng)液的配方如表3所示；
[0021] 表3連接反應(yīng)液配方
[0022]
[0023] (4)Ligase-65 連接酶；
[0024] (5)PCR反應(yīng)液，其包括如序列表SEQIDNO: 11至SEQIDNO:12所示的通用引物；
[0025] (6)SALSA聚合酶；
[0026] (7)DEPC水；
[0027] (8)陰性對照：無核酸滅菌水；
[0028] (9)陽性對照：為藍舌病病毒NS3基因、牛病毒性腹瀉病毒5'UTR基因、牛地方流 行性白血病病毒gP51基因、牛傳染性鼻氣管炎病毒gB基因、口蹄疫病毒3D基因的陽性重 組質(zhì)粒DNA的混合物。
[0029] 藍舌病病毒NS3基因陽性重組質(zhì)粒的制備：克隆藍舌病病毒NS3基因，回收PCR擴 增產(chǎn)物，長度為492bp，與pGEM-T載體（購自PromeGA公司）進行連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài) 細胞，堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR和酶切鑒定后獲得藍舌病病毒NS3的陽性重組質(zhì)粒，命 名為BTV-NS3-DNA;藍舌病病毒NS3基因序列如序列表中SEQIDNO:13所示。
[0030] 牛傳染性鼻氣管炎病毒gB基因陽性重組質(zhì)粒的制備：克隆牛傳染性鼻氣管炎病 毒gB基因，回收PCR擴增產(chǎn)物，長度為365bp，與pGEM-T載體（購自PromeGA公司）進行連 接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR和酶切鑒定后獲得牛傳染性鼻氣 管炎病毒gB基因的陽性重組質(zhì)粒，命名為IBRV-gB-DNA;牛傳染性鼻氣管炎病毒gB基因基 因序列如序列表中SEQIDNO:14所示。
[0031] 牛病毒性腹瀉病毒5'UTR基因的陽性重組質(zhì)粒的制備：克隆牛病毒性腹瀉病毒 5'UTR基因，回收PCR擴增產(chǎn)物，長度為284bp，與pGEM-T載體（購自PromeGA公司）進行 連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR和酶切鑒定后獲得牛病毒性 腹瀉病毒5'UTR基因的陽性重組質(zhì)粒，命名為BVDV-5'UTR-DNA;牛病毒性腹瀉病毒5'UTR 基因序列如序列表中SEQIDNO:15所不。
[0032] 牛地方流行性白血病病毒gP51基因的陽性重組質(zhì)粒的制備：克隆牛地方流行性 白血病病毒gP51基因，回收PCR擴增產(chǎn)物，長度為500bp，與pGEM-T載體（購自PromeGA公 司）進行連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR和酶切鑒定后獲得牛 地方流行性白血病病毒gP51基因的陽性重組質(zhì)粒，命名為EBLV-gP51-DNA;牛地方流行性 白血病病毒gP51基因序列如序列表中SEQIDNO:16所示。
[0033] 口蹄疫病毒3D基因體外轉(zhuǎn)錄RNA制備：擴增0型口蹄疫病毒3D基因的RT-PCR 擴增產(chǎn)物，長度為1410bp，與pGEM-T載體（購自Promega公司）進行連接，轉(zhuǎn)化JM109 感受態(tài)細胞