慶大霉素半抗原及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種慶大霉素半抗原及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 慶大霉素（Gentamicin，GM)屬于氨基糖甙類抗生素，主要作用于革蘭氏陰性細(xì) 菌，由于其具有廣譜抑菌和殺菌作用，被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床和動(dòng)物飼料添加劑。但GM的 血清有效濃度與毒性濃度很相近，安全范圍較小，在其應(yīng)用過(guò)程中易產(chǎn)生毒副作用，尤其大 劑量不規(guī)范使用，易導(dǎo)致動(dòng)物性食品中GM殘留超標(biāo)，對(duì)人體健康構(gòu)成危害，造成腎毒性和 耳毒性。許多國(guó)家在動(dòng)物生產(chǎn)中嚴(yán)禁使用GM或規(guī)定有嚴(yán)格的最高殘留限量（MRL)，我國(guó)農(nóng) 業(yè)部235號(hào)公告規(guī)定，動(dòng)物性食品中GM的MRL為100ng/g。
[0003] 目前慶大霉素殘留檢測(cè)方法主要有氣相色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-串 聯(lián)質(zhì)譜法、高效毛細(xì)管電泳法和免疫學(xué)檢測(cè)法。儀器法檢測(cè)價(jià)格昂貴，不適合在基層推廣使 用和大量篩選。免疫學(xué)測(cè)定方法靈敏度較高，特異性強(qiáng)，使用方便。因此，大規(guī)模篩選檢測(cè) 以免疫學(xué)檢測(cè)方法更實(shí)際、更具有應(yīng)用前景。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)以其靈敏度高、特異 性好、操作簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)點(diǎn)適合于大量樣品的快速篩選。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種慶大霉素半抗原及其制備方法和應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明提供的慶大霉素半抗原分子結(jié)構(gòu)式如式I所示：
[0006]
[0007]
[0008] 本發(fā)明提供的慶大霉素半抗原的制備方法，包括如下步驟：
[0009] 在IOOmL兩口燒瓶中加入0.5g對(duì)溴甲基苯甲酸及1.05g慶大霉素和IOmL乙醇， 攪拌至溶解，加熱至45°C反應(yīng)6小時(shí)后，減壓蒸除溶劑。乙醇-水體系中重結(jié)晶得到對(duì)羧芐 基慶大霉素，得到半抗原產(chǎn)物。
[0010] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是上述慶大霉素半抗原在免疫檢測(cè)中的應(yīng)用，具體包括由所 述慶大霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到的慶大霉素抗原，及由所得慶大霉素抗原免疫動(dòng)物 制備得到的慶大霉素抗體，所述抗體為慶大霉素單克隆抗體。
[0011] 其中所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、甲狀腺蛋白、卵清蛋白、人血清蛋白、鼠血 清蛋白、兔血清蛋白、血藍(lán)蛋白或纖維蛋白原。
[0012] 本發(fā)明還提供由上述慶大霉素半抗原或慶大霉素抗原在檢測(cè)慶大霉素或制備檢 測(cè)慶大霉素的產(chǎn)品中的應(yīng)用，具體涉及制備的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)動(dòng)物源性食品中 慶大霉素殘留的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明提供的慶大霉素半抗原、慶大霉素抗原合成方法簡(jiǎn)單，通過(guò)免疫動(dòng)物產(chǎn)生 了針對(duì)慶大霉素的特異性抗體，抗體的效價(jià)、特異性都比較好；用所得的抗體制備酶聯(lián)免疫 檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)成本低，使用方便，檢測(cè)方法準(zhǔn)確、快速、可同時(shí)檢測(cè)大批量的樣本，適于 動(dòng)物源性食品中慶大霉素殘留的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本的篩查。本發(fā)明的慶大霉素半抗原在 慶大霉素的檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1 :慶大霉素半抗原合成路線圖
[0015] 圖2 :慶大霉素半抗原核磁共振圖
[0016] 圖3 :慶大霉素 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合具體的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本 發(fā)明，而不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0018] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法、材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法和 常規(guī)材料。
[0019] 實(shí)施例1 :慶大霉素半抗原的合成和鑒定（合成路線如圖1)
[0020] 在IOOmL兩口燒瓶中加入0.5g對(duì)溴甲基苯甲酸及I. 05g慶大霉素和IOmL乙醇， 攪拌至溶解，加熱至45°C反應(yīng)6小時(shí)后，減壓蒸除溶劑。乙醇-水體系中重結(jié)晶得到對(duì)羧芐 基慶大霉素，得到半抗原產(chǎn)物。
[0021] 上述慶大霉素半抗原分子結(jié)構(gòu)式如式I所示：
[0022]
[0023] 取上述產(chǎn)物用核磁共振確定結(jié)構(gòu)，如圖2所示，11. Oppm的羧基信號(hào)峰、7. 44ppm及 8. 09ppm的芳環(huán)信號(hào)峰，說(shuō)明半抗原合成成功。
[0024] 實(shí)施例2 :慶大霉素抗原的制備
[0025] 將慶大霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到慶大霉素抗原，分子結(jié)構(gòu)式如式II所示：
[0026]
[0027]
[0028] -、免疫原制備
[0029] 取14mg慶大霉素半抗原用ImL N, N-二甲基甲酰胺（DMF)溶解，各取30mg碳化 二亞胺（EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)用0.2mL水充分溶解后加入上述溶液中，室 溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A ;稱取牛血清白蛋白（BSA) 50mg，使之充分溶解在3. SmL PBS (pH7. 2)溶液中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h ;用 0.0 lmol/L PBS溶液在4°C透析3d，每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)；分裝， 于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0030] 二、包被原制備
[0031] 將BSA換為卵清蛋白（OVA)按上述方法制備得到包被原。
[0032] 實(shí)施例3 :慶大霉素單克隆抗體的制備
[0033] 動(dòng)物免疫：將實(shí)施例2中得到的免疫原注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為 150 μ g/只，使其產(chǎn)生抗血清。
[0034] 細(xì)胞融合和克隆化：小鼠血清測(cè)定結(jié)果較高后，取其脾細(xì)胞，按8:1比例與SP2/0 骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽(yáng)性孔。利用有限稀釋法對(duì)陽(yáng) 性孔進(jìn)行克隆化，直到得到分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0035] 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇：將慶大霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株用凍存液制成細(xì)胞懸液，在 液氮中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入 培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。
[0036] 單克隆抗體的生產(chǎn)與純化：將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0. 5mL/只，7天后 腹腔注射慶大霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹 水純化，-20°C保存。該單克隆抗體特異性好，檢測(cè)靈敏度可達(dá)0. 1 μ g/L。
[0037] 單克隆抗體的特異性
[0038] 抗體特異性是指它同特異性抗原結(jié)合的能力與同該類抗原類似物結(jié)合能力的比 較，常用交叉反應(yīng)率作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。交叉反應(yīng)越小，抗體的特異性則越高。
[0039] 將慶大霉素、鏈霉素、雙氫鏈霉素、新霉素做系列稀釋，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析得到 IC50,然后桉下式計(jì)笪奪叉反應(yīng)率，結(jié)果見(jiàn)表1。
[0043] 實(shí)施例4 :由慶大霉素單克隆抗體制備的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒
[0044] 一、酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的組成
[0045] (1)包被慶大霉素偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板；
[0046] (2)酶標(biāo)二抗或酶標(biāo)二抗?jié)饪s液；
[0047] (3)抗體工作液；
[0048] (4)標(biāo)準(zhǔn)品溶液：濃度分別為 0 μ g/L、0. 1 μ g/L、0. 3 μ g/L、0. 9 μ g/L、2. 7 μ g/L、 8. I μ g/L，高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為lmg/L ;
[0049] (5)底物顯色液由A液和B液組成，A液為過(guò)氧化脲，B液為四甲基聯(lián)苯胺溶液；
[0050] (6)終止液為2mol/L的硫酸溶液；
[0051] (7)濃縮洗滌液為含0· 5%~1. 0%的吐溫-20的0· 1~0· 2mol/L ρΗ7· 2~7. 4 的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比；
[0052] (8)濃縮復(fù)溶液為ρΗ7· 2~7. 6,0· 05~0· lmol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為 重量體積百分比。
[0053] 本試劑盒的主要試劑以工作液的形式提供，檢驗(yàn)方法方便易行，具有特異性高、靈 敏度高、精確度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。
[0054] 二、酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒檢測(cè)實(shí)際樣本的應(yīng)用
[0055] (一）樣本前處理方法一
[0056] 1、組織（雞肉、雞肝）樣本前處理方法
[0057] 稱取2. 0g±0. 05g去除脂肪的組織樣本至50mL聚苯乙烯離心管中，加入 6mL0. lmol/L PBS溶液（稱取13. 4g十二水合磷酸氫二鈉、20.0 g氯化鈉、0· 32g氫氧化鈉、 0. 5g二水合磷酸二氫鉀、0. 5g氯化鉀加入500mL去離子水溶解混勻），混勻IOmin ;加入 60°C水浴環(huán)境中60min，取出冷卻至室溫并搖勻；3000g以上，室溫（20-25°C /68-77 °F )離 心IOmin ;移取上清液與復(fù)溶工作液（用去離子水將2 X濃縮復(fù)溶液按1:1體積比進(jìn)行稀釋 (1份2X濃縮復(fù)溶液+1份去離子水）用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶工作液在4°C (39. 2 °F )環(huán)境 可保存一個(gè)月）以1:9的體積比進(jìn)行稀釋（50 μ L上清液+450 μ L復(fù)溶工作液），取50 μ L 用于分析。
[0058] 2、鮮牛奶樣本前處理方法
[0059] 取20 μ L鮮牛奶樣本至2mL聚苯乙烯離心管中，加入780 μ L復(fù)溶工作液，混勻，取 50 μ L用于分析。
[0060] 3、奶粉樣本前處理方法