一種純化利拉魯肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種多肽化合物的純化方法，主要是涉及到運(yùn)用不同基質(zhì)填料為固定相的色譜柱以及與不同純化體系相結(jié)合，純化一種固相合成利拉魯肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一種全球性的高發(fā)病，全球約有4億2型糖尿病患者，到2035年，這一數(shù)字將接近6億，其中80%生活在中低收入國(guó)家。據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)2010年糖尿病患者近9200萬(wàn)。由于糖尿病涉及全身各個(gè)系統(tǒng)，甚至誘發(fā)愈多致使性并發(fā)癥，嚴(yán)重影響任的勞動(dòng)能力，并威脅人的生命安全，對(duì)你們的健康形成極大的危害。盡管已有多個(gè)2型糖尿病管理的臨床指南，但目前尚缺乏不同國(guó)家和地區(qū)患者管理模式、影響治療決策的因素以及相應(yīng)治療結(jié)局的相關(guān)資料。紀(jì)立農(nóng)教授等開(kāi)展的DISCOVER(NCT02322762)研究項(xiàng)目將提供來(lái)自5大洲25個(gè)國(guó)家12000名2型糖尿病患者的相關(guān)數(shù)據(jù)。
[0003]利拉魯肽是第一個(gè)也是目前唯一一個(gè)人GLP-1 (胰高素樣肽-1)類似物，可以長(zhǎng)效治療糖尿病，在歐洲美國(guó)日本已獲廣泛應(yīng)用。胰高素樣肽-1是一種腸促胰素，當(dāng)口服攝入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)時(shí)，胰高素樣肽-1可以促進(jìn)胰島素的分秘，但人體的GLP-1可被二肽基肽酶-4(DPP-4)迅速降解。利拉魯肽是GLP-1受體完全激動(dòng)劑，其97%的氨基酸序列和人GLP-1分子相同。人結(jié)構(gòu)上說(shuō)，兩個(gè)分子間只有兩處存在差別，首先C16脂肪酸在第26位上通過(guò)谷氨酸連接到賴氨酸上。其次，在第34們上賴氨酸被精氨酸所替代，以確保C16側(cè)鏈只能結(jié)合在第26位上。脂肪酸側(cè)鏈可以使利拉魯肽在血夜中與白蛋白可逆性地結(jié)合，使利拉魯肽的作用時(shí)間延長(zhǎng)，且增強(qiáng)對(duì)DPP-4酶降解的抵抗，脂肪酸側(cè)鏈還可以使利拉魯肽分子在注射部位自交聯(lián)成七聚體，從而延緩其自皮下吸引，使其作用時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)接近24小時(shí)，每天注射一次并且可在任意時(shí)間注射，與進(jìn)餐無(wú)關(guān)。適合成人2型糖尿病患者，以葡萄糖濃度依賴的方式調(diào)節(jié)血糖，直接保護(hù)B細(xì)胞，增加胰島素分泌和減少a細(xì)胞不當(dāng)?shù)囊雀咛撬胤置?，通過(guò)提高飽腹感和減少熱量攝入而降低體重，降低收縮壓.越早應(yīng)用越好。利拉魯肽絕對(duì)是2型糖尿病治療領(lǐng)域革命性的藥物。
[0004]2008年諾和諾德公司研制出治療糖尿病的新藥，胰高糖素樣多肽-1 (GLP-1)類似物一利拉魯肽(Liraglutide)。利拉魯肽是胰升血糖素樣肽I ( GLP-1)經(jīng)脂肪酸修飾后的衍生物，可降低2型糖尿病(T2DM)患者的HbAlc水平、降低體重和改善β細(xì)胞功能。由于它僅在人體血糖高于正常值時(shí)才刺激胰島素分泌，抑制胰高血糖素分泌，因此不會(huì)引起嚴(yán)重低血糖不良反應(yīng)。2010年I月25日，利拉魯肽被FDA批準(zhǔn)用于治療2型糖尿病，可單獨(dú)作為2型糖尿病的二線治療藥物，也可與其他口服降糖藥聯(lián)合使用。利拉魯肽注射劑是等滲注射液，經(jīng)皮下注射給藥，血藥濃度達(dá)峰時(shí)間為10~14h，半衰期為ll~13h，每日注射一次，提供24h的血糖控制，其藥代動(dòng)力學(xué)特性不受性別或年齡影響。
[0005]目前也有不少針對(duì)純化利拉魯肽的方法以及相關(guān)的專利，但是都有一個(gè)問(wèn)題在里面，步驟繁瑣并且收率很低，還有一些專利里面涉及到的色譜柱子的填料品種較多并且有些填料也是非常昂貴的。因?yàn)槔旊氖且粋€(gè)很疏水的三十一肽，采用一般的純化方法不僅分離效果不好而且收率很低柱子損傷也很大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一條適于純化利拉魯肽的方法，主要解決現(xiàn)有技術(shù)分離得到利拉魯肽純度較低且收率低的技術(shù)問(wèn)題。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一種純化利拉魯肽的方法，其特征在于，包括如下步驟:
O將固相合成的利拉魯肽粗樣溶解于質(zhì)量百分濃度為10%的稀氨水溶解中，得粗液；2)取粗液，以聚苯乙烯二乙烯苯基質(zhì)的填料為固定相，配置含有質(zhì)量百分濃度為0.1%的氨水水溶液為B相，含有質(zhì)量百分濃度為0.1%氨水乙腈溶液為A相，梯度為20-70%，檢測(cè)波長(zhǎng)245nm進(jìn)行HPLC線性梯度洗脫，得到第一步樣品溶液，樣品溶液為偏堿性；
3 )取第一步樣品溶液用質(zhì)量百分濃度為20%的碳酸氫銨調(diào)樣品溶液pH值至偏中性，然后對(duì)樣品溶液減壓濃縮至50-500ml左右(去除過(guò)多的乙腈溶液，為第二步純化做準(zhǔn)備)；
4)將偏中性的樣品溶液進(jìn)行第二步純化，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，配置含有質(zhì)量百分濃度為0.01%的鹽酸水溶液為B相，含有質(zhì)量百分濃度為0.01%的鹽酸乙腈溶解為A相，梯度為40-65%進(jìn)行HPLC線性梯度洗脫，得到第二步樣品溶解，樣品溶液為偏酸性；
5)取第二步樣品溶液用弱堿性陰離子樹(shù)脂轉(zhuǎn)鹽至偏弱堿性，得到含有弱堿性樣品溶液，弱堿性條件下的利拉魯肽產(chǎn)品相對(duì)更加穩(wěn)定；
6)將轉(zhuǎn)鹽后的樣品溶解進(jìn)行減壓濃縮，冷凍，干燥，得到最終產(chǎn)品。
[0008]本發(fā)明的有益效果:經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)聚苯乙烯二乙烯苯可以承受強(qiáng)酸強(qiáng)堿，以此填料為固定相的色譜柱，加上堿性質(zhì)量百分濃度為0.1%的氨水體系做第一步純化，然后再用以普通十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，加上質(zhì)量百分濃度為0.05%的鹽酸體系做第二步純化。兩大步驟最終能得到高純度的利拉魯肽成品，且收率高達(dá)64.5%。
【具體實(shí)施方式】
[0009]一種純化利拉魯肽的方法，包括如下步驟:
1.樣品處理:將固相合成所得的利拉魯肽用質(zhì)量百分濃度為10%左右的稀氨水來(lái)溶解(溶解濃度約為15mg/ml)，用孔徑為0.45um濾膜過(guò)濾后收集濾液備用；
2.純化
第一步純化條件:色譜柱:以聚苯乙烯二乙烯苯基質(zhì)的填料為固定相的色譜柱，柱子直徑和長(zhǎng)度為:3CmX25Cm.流動(dòng)相:A相:配比含有質(zhì)量百分濃度為0.1%的氨水水溶液；B相:配比含有質(zhì)量百分濃度為0.1%的氨水乙腈溶液。流速:25-30ml/min。檢測(cè)波長(zhǎng):245nm。梯度:流動(dòng)相B的質(zhì)量百分濃度:20-65%，梯度處理時(shí)間40-55min。進(jìn)樣量為0.8g ;
純化過(guò)程:將色譜柱用質(zhì)量百分濃度90%以上的乙腈沖洗干凈后上樣，上樣量為溶解過(guò)濾之后的樣品溶液。線性梯度洗脫，收集目的峰，純度為92%左右，將收集好的肽溶液放置收集瓶中備用；
3.將純化后收集的肽溶液用20%的碳酸氫胺調(diào)樣品溶液PH值至偏中性，減壓濃縮至一定體積50-100ml除過(guò)多的乙腈，為了第二步純化做準(zhǔn)備)
4.第二步純化條件:色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長(zhǎng)度為:3CmX25Cm，流動(dòng)相:A相配比含有質(zhì)量百分濃度為0.01%的鹽酸水溶液；B相:色譜純乙腈溶液；流速:25-30ml/min ;檢測(cè)波長(zhǎng):245nm.梯度:流動(dòng)相B的質(zhì)量百分濃度:40-60%，梯度處理時(shí)間45-60min ;進(jìn)樣量為第一步純化濃縮之后含量92%的樣品溶液；
純化過(guò)程:將色譜柱用質(zhì)量百分濃度90%以上的乙腈沖洗干凈后上樣，上樣量為第一步純化濃縮之后含量92%的樣品溶液，線性梯度洗脫，收集目的峰，純度為98%左右，將收集好的肽溶液放置收集瓶中備用；
5.轉(zhuǎn)鹽:取10g陰離子交換樹(shù)脂LeratitMP60置于大小合適的轉(zhuǎn)鹽玻璃柱中，用超純水，乙醇，堿洗，酸洗，再堿洗等一系列步驟沖洗至中性后再上樣使用，將濃縮后的肽溶液倒入轉(zhuǎn)鹽玻璃柱中，通過(guò)控制液體樣品的流速來(lái)達(dá)到轉(zhuǎn)鹽的目的，同時(shí)收集轉(zhuǎn)鹽后的肽溶液；
6.將轉(zhuǎn)鹽后所得的所有肽溶液，進(jìn)行減壓濃縮至lg/50ml，濃縮溫度不超過(guò)40°C，然后冷凍干燥得純度大于98.0%的利拉魯肽，純化收率可得60%以上。
[0010]實(shí)施例2
1.樣品處理:將固相合成所得的利拉魯肽用質(zhì)量百分濃度為10%左右的稀氨水來(lái)溶解(溶解濃度約為30mg/ml)，用孔徑為0.45um濾膜過(guò)濾后收集濾液備用；
2.純化
第一步純化條件:色譜柱:以聚苯乙烯二乙烯苯基質(zhì)的填料為固定相的色譜柱，柱子直徑和長(zhǎng)度為:5CmX25Cm.流動(dòng)相:A相:配比含有質(zhì)量百分濃度為0.1%的氨水水溶液；B相:配比含有質(zhì)量百分濃度為0.1%的氨水乙腈溶液。流速:45-50ml/min。檢測(cè)波長(zhǎng):245nm。梯度:流動(dòng)相B的質(zhì)量百分濃度:30-70%，梯度處理時(shí)間50-60min。進(jìn)樣量為2.785g ;
純化過(guò)程:將色譜柱用質(zhì)量百分濃度90%以上的乙腈沖洗干凈后上樣，上樣量為溶解過(guò)濾之后的樣品溶液。