一種制備利那洛肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及多肽合成領(lǐng)域，特別涉及一種制備利那洛肽的方法。 技術(shù)背景
[0002] 利那洛妝（LINZESS)是由美國 Ironwood Pharmaceuticals 公司研發(fā)，于 2012 年 12月17日首次獲批在美國上市的一種用于治療胃腸道疾病的多肽類藥物，并于2013年先 后在丹麥、芬蘭、德國、挪威、瑞典及英國等國家上市，目前暫未申報進(jìn)口中國（但是已在中 國做國際多中心臨床III期試驗）。本品是FDA唯一批準(zhǔn)的可用于臨床的腸道局部起效的 GC-C (鳥苷酸環(huán)化酶-C)激動劑類藥物，也是歐洲首個獲批用于治療中重度IBS-C成人患者 新型處方藥物。利那洛肽膠囊（LINACLOTIDE capsules)規(guī)格為：145MCG/粒；290MCG/粒。
[0003] 利那洛肽是由14個氨基酸殘基組成的含有三對二硫鍵的多肽，其結(jié)構(gòu)如下：
[0004]
[0005] 文獻(xiàn) Optimized Fmoc Solid-Phase Synthesis of the Cysteine-Rich Peptide Linaclotide，Peptide Science Volume 96，Number l，p69 報道了利那洛肽的合成方法，該 文獻(xiàn)中主要介紹了以下三種利那洛肽的合成策略：（1)采用6-Trt的保護策略，通過Fmoc 固相法合成利那洛肽線性粗肽后，在溶液中一步氧化形成三對二硫鍵，但由于選擇性差，粗 肽中存在多種二硫鍵錯配異構(gòu)體雜質(zhì)，導(dǎo)致目標(biāo)肽收率較低；（2)采用2Mmt+2Acm+2Trt策 略，以Wang樹脂為固相載體合利那洛肽全保護線性肽后，在保證Trt不被脫除的情況下，脫 除Mmt，然后在樹脂上氧化形成第一對二硫鍵，再將肽鏈從樹脂上裂解下來，同時脫除Trt， 再分步氧化形成第二對和第三對二硫鍵，此方法選擇性強，但在樹脂上形成第一對二硫鍵 難度較大，導(dǎo)致粗肽純度及收率都很低；（3)采用2StBu+4Trt保護策略，通過固相法合成利 那洛肽全保護線性肽后，先選擇性脫去StBu，氧化形成第一對二硫鍵，然后再脫除全部保護 基，一步氧化形成第二對及第二對二硫，此方法中原料Fmoc-Cys (StBu)-OH價格較高，同時 粗肽中也存在多種二硫鍵錯配異構(gòu)體雜質(zhì)。
[0006] 專利 CN102875655A、CN104231051A、CN104628826A和 CN201410357720. 3 介紹了一 步氧化形成三對二硫鍵的方法：首先合成利那洛肽樹脂，然后將利那洛肽樹脂裂解脫除所 有保護基和樹脂固相載體得到利那洛肽線性粗肽，最后對線性肽采用GSH/GSSH氧化體系 或其他氧化體系進(jìn)行一步氧化反應(yīng)；其中專利CN201410357720. 3公開了一種先以片段法 合成利那洛肽線性肽，然后再通過GSH/GSSH氧化體系一步氧化形成三對二硫鍵的方法。雖 然一步氧化法能夠通過緩沖體系使線性肽盡量向目標(biāo)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，但仍然無法避免二硫鍵錯 配異構(gòu)體雜質(zhì)的產(chǎn)生，收率較低。
[0007] 專利CN103626849A公開了采用同一溶液體系，分步形成成三對二硫鍵，此法雖能 夠避免二硫鍵錯配異構(gòu)體雜質(zhì)的產(chǎn)生，但同一體系反應(yīng)，處理過程復(fù)雜，且原料來源較少， 成本相對較高。
[0008] 總之，在制備利那洛肽的過程中存在二硫鍵錯配導(dǎo)致異構(gòu)體雜質(zhì)的產(chǎn)生以及第一 對二硫鍵形成難度較大的問題，本申請的技術(shù)方案不僅能夠避免二硫鍵錯配產(chǎn)生的異構(gòu)體 雜質(zhì)，降低了純化過程的難度，而且片段法有利于第一對二硫鍵的形成，使最終所得粗肽純 度與收率均較高，本法操作過程簡便，適于大規(guī)模生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 為解決合成過程中存在的以上問題，本發(fā)明提供了一種制備利那洛肽的方法，本 發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：
[0010] -種制備那洛肽的方法，包括如下步驟：
[0011] (a)固相合成片段I線性肽：以CTC樹脂為固相載體，通過Fmoc固相合成法合成 片段I肽樹脂，經(jīng)裂解反應(yīng)，得到片段I線性肽，其結(jié)構(gòu)如下：
[0012] Fmoc-Cys-Cys(Acm)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Cys-OH
[0013] (b)第一對二硫鍵形成：將片段I線性肽溶解在溶液中氧化形成第一對二硫鍵，得 到片段I氧化肽，其結(jié)構(gòu)如下：
[0014]
[0015] (c)固相合成片段II肽樹脂：以Wang脂或CTC樹脂作為固相載體，通過Fmoc固相 合成法合成片段II肽樹脂，其結(jié)構(gòu)如下：
[0016] H-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys(Acm)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Resin
[0017] (d)含一對二硫鍵利那洛肽的合成：片段I氧化肽經(jīng)縮合試劑活化后，與片段II肽 樹脂偶聯(lián)并脫除Fmoc保護基，經(jīng)裂解反應(yīng)，得到含一對二硫鍵的利那洛肽粗肽，其結(jié)構(gòu)如 下：
[0019] (e)第二對二硫鍵的形成：將上述粗肽溶解在溶液中，調(diào)節(jié)pH，加入氧化劑氧化形 成第二對二硫鍵，其結(jié)構(gòu)如下：
[0021] (f)第三對二硫鍵的形成：在上步溶液中加入AcOH，混和均勻后，再加入I2進(jìn)行攪 拌反應(yīng)，最后加入Vc還原過量的I 2，終止反應(yīng)，氧化形成第三對二硫鍵，其結(jié)構(gòu)如下：
[0022]
[0023] 優(yōu)選的，步驟（a)中，操作過程為：第6位保護氨基酸Fmoc-Cys (Mmt) -OH 與CTC樹脂反應(yīng)，制得Fmoc-Cys (Mmt) -CTC樹脂，然后在縮合試劑的作用下逐一偶 聯(lián) Fmoc-Cys(Trt)-〇H、Fmoc-Tyr(tBu)-〇H、Fmoc_Glu(OtBu)-〇H、Fmoc_Cys(Acm)-〇H、 Fmoc-Cys(Mmt)-OH獲得片段I肽樹脂；將片段I肽樹脂加入到裂解液中，20-25°C下反應(yīng) 3-5min，重復(fù)裂解3-5次；反應(yīng)結(jié)束，將裂解液過濾并合并到一起；用0. 1-1. Omol/L NaHCO3 水溶液洗滌裂解液，直至pH為7-8 ;旋蒸濃縮裂解液，過濾收集析出的沉淀，真空干燥得片 段I線性肽；
[0024] 更為優(yōu)選的，上述步驟中的裂解液為加入體積比1-10% TFA及體積比1-5% TIS 的DCM溶液；
[0025] 步驟（b)中，氧化形成第一對二硫鍵的條件為：將片段I線性肽溶解在溶劑中，形 成濃度為〇· 5-5. Omg/mL的溶液，用氨水調(diào)節(jié)溶液pH值至7. 0-8. 0,以DMSO, H2O2,或空氣中 的任意一種為氧化劑，氧化反應(yīng)10_20h，旋蒸濃縮反應(yīng)液，過濾收集析出的沉淀，真空干燥 得片段I氧化肽；
[0026] 優(yōu)選的，單獨用DMSO做氧化劑時用量為溶液體積的5-30%，單獨用H2O 2做氧化劑 時的用量為溶液體積〇. 05-0. 5%的30% H2O2溶液，單獨采用空氣做氧化劑時采用通入的方 式；
[0027] 步驟（c)中，片段II肽樹脂的合成過程為：第14位保護氨基酸Fmoc-Tyr (tBu) -OH 與載體樹脂反應(yīng)，制得Fm〇C-Tyr(tBu)-樹脂，然后在縮合試劑的作用下逐一偶聯(lián) Fmoc-Cys (Trt)-OH、Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Thr (tBu)-OH、Fmoc-Cys (Acm)-OH、Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asn (Trt) -〇H，獲得片段 II 肽樹脂；
[0028] 步驟（d)中，含一對二硫鍵利那洛肽的合成過程為：片段I氧化肽與與片段II肽樹 脂在縮合試劑的作用下，發(fā)生接肽反應(yīng)，生成含一對二硫鍵的利那洛肽肽樹脂，然后再用裂 解劑進(jìn)行l(wèi)_3h裂解反應(yīng)，最后過濾裂解液，經(jīng)甲叔醚沉降洗滌，真空干燥得含一對二硫鍵 的利那洛肽粗肽；
[0029] 更為優(yōu)選的，步驟（d)中的裂解液為加入體積比1-5%清除劑的TFA溶液，所述清 除劑為苯甲醚、苯甲硫醚、苯酚、水和三異丙基硅烷中的一種或幾種；
[0030] 優(yōu)選的，步驟（a)或步驟（c)或步驟（d)中，所述的CTC樹脂或Wang樹脂的替代 度為 0· 5-1. Ommol/g，所述縮合劑為 DIC/HOBt、DIC/HOAt、TBTU/HOBt/DIPEA、HBTU/HOBt/ DIPEA、HATU/HOAtDIPEA 的一種；
[0031] 優(yōu)選的，步驟（e)中，氧化形成第二對二硫鍵的條件為：將步驟（d)中所得含一對 二硫鍵的利那洛肽粗肽溶解在溶劑中，形成濃度為0. 5-5. Omg/mL的溶液，用氨水調(diào)節(jié)溶液 pH值至7. 0-8. 0,以DMS0, H2O2，或空氣中的任意一種為氧化劑，攪拌反應(yīng)5-10h ;
[0032] 優(yōu)選的，單獨用DMSO做氧化劑時用量為溶液體積的5-30%，單獨用H2O2做氧化劑 時的用量為溶液體積〇. 05-0. 5%的30% H2O2溶液，單獨采用空氣做氧化劑時采用通入的方 式。
[0033] 更為優(yōu)選的，步驟（b)或步驟（e)中，所述溶劑為DCM，DMF，乙醇，乙腈，甲醇與水 任意一種或幾種混合液；
[0034] 優(yōu)選的，步驟（f)中，氧化形成第三對二硫鍵的條件為：向步驟（e)的反應(yīng)液中加 入溶液體積10-30%的AcOH，混合均勻后，加入10-50倍當(dāng)量的I 2，攪拌反應(yīng)0. 5-4h，反應(yīng) 結(jié)束，加入與I2相同當(dāng)量的Vc還原過量的I 2，終止反應(yīng)。
[0035] 更為優(yōu)選的，步驟（f)中，AcOH的用量為溶液體積的10%，12的用量為10倍當(dāng)量， 攪拌反應(yīng)Ih。
[0036] 相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果是：
[0037] 本發(fā)明提供的一種片段法完全選擇性形成三對二硫鍵利制備那洛肽的方法，可以 避免二硫鍵錯配異構(gòu)體雜質(zhì)的產(chǎn)生，降低了純化難度，粗肽的純度及收率均較高，原料廉價 易得，工藝操作簡單，適于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。
【具體實施方式】
[0038] 下面用具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但不限定本專利；根據(jù)本發(fā)明改變原 料的投料比或是反應(yīng)溶劑及縮合劑等，均在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0039] 說明書和權(quán)利要求書中所使用的縮寫含義如下：
[0040]

[0042] 實施例 I :Fmoc_Cys (Mmt)-CTC 樹脂的制備
[0043] 準(zhǔn)確稱取CTC樹脂（1.0mmol/g)320g置于肽樹脂合成反應(yīng)器中，加入3L DCM溶 脹lh。溶脹結(jié)束，以DMF洗滌3次，每次3L。稱取Fmoc-Cys (Mmt) -OH 394g、HOBt 87g用 2L DMF溶解后，加入IlOmL DIC活化，將溶液加入到反應(yīng)器中，反應(yīng)4h。反應(yīng)結(jié)束，樹脂以 DMF洗滌3次，然后加入預(yù)先配制的封端試劑（2. 5L DCM，0. 3L甲醇，0. 2L DIEA)，封端反應(yīng) lh。封端完成后，DMF洗滌4次，DCM洗滌2次，甲醇洗滌3次，每次3L，然后真空干燥樹脂， 共得Fmoc-Cys (Mmt) -CTC樹脂507g，取少量樹脂，測定Fmoc-Cys (Mmt) -CTC樹脂的替代度為 0. 61mmol/g。經(jīng)計算，合成規(guī)模為309mmol。
[0044] 實施例2 :片段I肽樹脂的制備
[0045] 稱取實施例 1 中替代度為 0· 61mmol/g 的 Fmoc-Cys (Mmt)-CTC 樹脂 493g (300mmol) 置于肽樹脂合成反應(yīng)器中，加入4L DCM溶脹2h。溶脹結(jié)束，以DMF洗滌3次，每次4L，然 后加入4L 20 %哌啶/DMF溶液脫保護兩次，分別進(jìn)行IOmin和lOmin。脫保護結(jié)束，樹脂 以 DMF 洗滌 6 次，每次 4L。稱取 Fmoc-Cys (Trt) -OH352g、HOBt 81g 用 2L DMF 溶解后，加 入103mL DIC活化，將溶液加入到反應(yīng)器中，反應(yīng)2h，Kaiser test監(jiān)測反應(yīng)終點。反應(yīng) 結(jié)束，樹脂以DMF洗滌5次，然后脫保護偶聯(lián)下一位保護氨基酸。重復(fù)上述步驟，依次進(jìn)行 Fmoc-Tyr (tBu) -〇H、Fmoc_Glu (OtBu) -〇H、Fmoc_Cys (Acm) -〇H、Fmoc_Cys (Mmt) -OH 的偶聯(lián)，制 備 Fmoc-Cys (Mmt) -Cys (Acm) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Cys (Trt) -Cys (