一種擬南芥zfn3蛋白多克隆抗體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種擬南芥ZFN3蛋白多克隆抗體及其制備 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 擬南芥，是在植物科學(xué)，包括遺傳學(xué)和植物發(fā)育研究中的模式生物之一。擬南芥的 優(yōu)點(diǎn)是植株小、每代時(shí)間短、結(jié)子多、生活力強(qiáng)。擬南芥的基因組是目前已知植物基因組中 最小的。其整個(gè)基因組已于2000年由國際擬南芥菜基因組合作聯(lián)盟聯(lián)合完成，也是第一個(gè) 被順序分析的植物基因組。擬南芥是自花受粉植物，基因高度純合，用理化因素處理突變率 很高，容易獲得各種代謝功能的缺陷型。由于具有上述這些優(yōu)點(diǎn)，所以擬南芥是進(jìn)行遺傳學(xué) 研究的理想材料，被科學(xué)家譽(yù)為"植物中的果蠅"。
[0003] 轉(zhuǎn)錄因子是一組識別特異DNA序列的蛋白，能促進(jìn)或抑制某些特定基因的轉(zhuǎn)錄及 表達(dá)，從而導(dǎo)致組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變。轉(zhuǎn)錄因子ZFN3是一種特殊的鋅指蛋白（zinc finger protein)，它含有五個(gè)CCCH鋅指結(jié)構(gòu)，在擬南芥葉片衰老過程中，表達(dá)量逐漸升高。 擬南芥yuc6-lD的突變體，能夠通過不斷積累生長素，來推遲葉片的衰老，通過基因芯片 分析表明，ZFN3基因在該突變體中，表達(dá)量顯著下降，ZFN3蛋白編碼基因已經(jīng)被北京大學(xué) Leaf Senescence Database收錄為調(diào)節(jié)葉片衰老的候選基因。但目前關(guān)于ZFN3蛋白的抗 體未見報(bào)道。
[0004] 因此有必要提供一種針對擬南芥ZFN3蛋白的多克隆抗體，從而為研究和利用該 蛋白的生物學(xué)功能提供有力工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于填補(bǔ)現(xiàn)有的擬南芥ZFN3蛋白檢測領(lǐng)域的空白，開發(fā)一種針對 擬南芥ZFN3蛋白的多克隆抗體及其制備方法。
[0006] -種擬南芥ZFN3蛋白多克隆抗體的制備方法，該方法包括以下步驟：
[0007] (1)構(gòu)建含有SEQ ID No :1和SEQ ID No :2所示核苷酸序列的重組表達(dá)載體，將 所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞獲得重組蛋白抗原；
[0008] (2)將所述重組蛋白抗原免疫動(dòng)物，經(jīng)血清分離純化獲得擬南芥ZFN3蛋白多克隆 抗體。
[0009] 其中，所述SEQ ID No :1和SEQ ID No :2所示核苷酸序列為發(fā)明人通過對擬南芥 ZFN3蛋白序列進(jìn)行大量分析比對發(fā)現(xiàn)的兩條特異性多肽片段的編碼DNA。
[0010] 可選的，所述重組表達(dá)載體含有如SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列。其中，SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列含有SEQ ID No :1和SEQ ID No :2所示核苷酸序列，為了使 得SEQ ID No :1和SEQ ID No :2所示的核苷酸序列所編碼的多肽片段能夠在大腸桿菌 感受態(tài)細(xì)胞中準(zhǔn)確高效的表達(dá)獲得重組蛋白抗原，發(fā)明人在這兩段序列之間加入了一段 GGGGGGGGGGGGTCC 序列。
[0011] 可選的，所述重組表達(dá)載體是將含有SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的核苷酸 序列的片段克隆至原核表達(dá)載體獲得的。
[0012] 可選的，所述重組蛋白抗原含有如SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示的氨基酸序 列。
[0013] 優(yōu)選的情況下，所述重組蛋白抗原含有如SEQ ID No. 6所示的氨基酸序列。
[0014] 本發(fā)明對于所使用的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的種類沒有特別的限制，只要能夠適合 重組表達(dá)載體在細(xì)胞中有效表達(dá)即可，優(yōu)選的情況下，為了獲得更好的表達(dá)效果，大腸桿菌 感受態(tài)細(xì)胞為大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。
[0015] 在本發(fā)明中，可以利用本領(lǐng)域常規(guī)適合于重組蛋白抗原的原核表達(dá)載體，優(yōu)選的 情況下，當(dāng)所述原核表達(dá)載體為pE-SUMOpro時(shí)，重組蛋白抗原的表達(dá)效果更好。
[0016] 在本發(fā)明所提供的方法中，免疫動(dòng)物的步驟包括4次免疫，首先將純化的重組蛋 白抗原與完全弗氏佐劑混合后第1次免疫動(dòng)物，而后將純化的重組蛋白抗原與非完全弗氏 佐劑混合后進(jìn)行第2-4次免疫，每次免疫的時(shí)間間隔為14天。
[0017] 在本發(fā)明中，免疫動(dòng)物時(shí)所使用的免疫劑量及與佐劑的混合比例都可以按照本領(lǐng) 域常規(guī)的方法進(jìn)行。免疫的動(dòng)物包括但不限于新西蘭大白兔、小白鼠和大白鼠。
[0018] 在第四次免疫后第10天，取動(dòng)物血液，收集抗血清，利用純化試劑獲得純度不低 于80%的擬南芥ZFN3多克隆抗體。
[0019] 本分發(fā)明還提供了利用本發(fā)明所述的方法制備的擬南芥ZFN3蛋白多克隆抗體。 所述多克隆抗體能夠特異性的識別ZFN3蛋白中的特異性氨基酸片段SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5,為ZFN3蛋白的特異性抗體。
[0020] 本發(fā)明還提供了所述的擬南芥ZFN3蛋白多克隆抗體的應(yīng)用。所述應(yīng)用包括制備 含有所述擬南芥ZFN3蛋白多克隆抗體的試劑或試劑盒，用于檢測擬南芥ZFN3蛋白或進(jìn)行 功能鑒定。
[0021] 本發(fā)明所提供的方法通過PCR方法克隆得到擬南芥ZFN3蛋白編碼DNA中的兩段 特異性片段的編碼DNA，從而獲得特異性的多克隆抗體。利用本發(fā)明所提供的方法制備的多 克隆抗體，能夠特異性識別擬南芥ZFN3蛋白，而不能識別擬南芥其他蛋白，在ZFN3蛋白的 檢測和功能鑒定、研究中具有廣泛用途。ZFN3蛋白抗體的制備為在擬南芥中檢測ZFN3蛋白 及研究ZFN3蛋白功能具有一定的意義。
【附圖說明】
[0022] 圖1為目的DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果；
[0023] 圖2為原核表達(dá)載體菌體PCR檢測電泳圖；
[0024] 圖3為重組蛋白SDS-PAGE電泳圖；
[0025] 圖4為重組蛋白純化后SDS-PAGE電泳圖，其中，M為蛋白Marker ; 1和2為純化的 蛋白；箭頭指示的條帶為目標(biāo)蛋白條帶；
[0026] 圖5為擬南芥Western檢測圖片。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 以下將對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)的說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的
【具體實(shí)施方式】僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0028] 以下實(shí)施例中所使用的儀器和試劑均可以通過購買市售產(chǎn)品的方式獲得。
[0029] 實(shí)施例1
[0030] 1、擬南芥ZFN3蛋白序列獲得
[0031] 在北京天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)公司通過全基因合成的方法，合成用于原核表達(dá)載體構(gòu) 建的DNA序列，即合成SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，將SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列 克隆至載體pGM-Τ (購自北京天根生物公司）中，經(jīng)DNA測序序列正確，將其命名為pGM-ZP 質(zhì)粒。
[0032] 2、原核表達(dá)載體構(gòu)建：設(shè)計(jì)一對引物用于構(gòu)建原核表達(dá)載體引物：
[0033] ZP-f :5' -GAACAGATTGGAGGTAACTTGATGGTTTCTGTTCG-3'
[0034] ZP-r :5' -GTGAGACCGGTACCATCAGAATTCGAGTGATGTGGG-3'
[0035] 以pGM-ZP質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序?yàn)椋?5°C變性30s，60°C退火30s， 72°C延伸30s，25個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析，獲得約為250bp的DNA條帶（圖I)， 產(chǎn)物回收純化待用。
[0036] 提取原核表達(dá)載體pE-SUMOPro質(zhì)