一株具高抗氧化活性的植物乳桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一株具高抗氧化活性的植物乳桿菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物氧化是機體新陳代謝的重要生理過程，但此過程中會產(chǎn)生自由基等各種活性 氧分子（ROS)。盡管正常情況下，機體存在著自由基清除系統(tǒng)，但如果機體受到某些因素影 響，自由基清除系統(tǒng)出現(xiàn)故障導致體內(nèi)自由基過度產(chǎn)生，則會作用于機體內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸 等分子，造成細胞損傷，給機體健康帶來很大威脅。通過膳食中補充抗氧化物質(zhì)可以增強機 體的抗氧化能力，但許多化學合成的抗氧化劑存在安全問題。乳酸菌作為腸道常駐菌群，可 以直接在機體氧化損傷的重點部位-腸道發(fā)揮抗氧化作用，維持腸道處于氧化還原平衡狀 態(tài)。并且乳酸菌在腸道定植后還能不斷增殖，產(chǎn)生更多能夠發(fā)揮抗氧化作用的乳酸菌，源源 不斷地在腸道扮演ROS清道夫的角色。因此乳酸菌的抗氧化作用與傳統(tǒng)的抗氧化劑相比有 更多的優(yōu)勢。
[0003] 近些年許多體外和體內(nèi)實驗已證明一些乳酸菌具有良好的抗氧化活性，Li等對分 離自中國傳統(tǒng)發(fā)酵食物中的11株植物乳桿菌體內(nèi)外抗氧化能力進行了研究，發(fā)現(xiàn)植物乳 桿菌C88乳酸菌的抗氧化活性已經(jīng)得到體內(nèi)及體外試驗的證實。能較好地緩解D-半乳糖 誘導的小鼠氧化應(yīng)激；Kullisaar等利用人體實驗表明發(fā)酵乳桿菌ME-3具有抗氧化活性。
[0004] 本研究從市售泡菜中分離得到的7株菌并對其進行抗氧化性能篩選，篩選到一株 具強抗氧化性能的植物乳桿菌，分析其抗氧化機理，并對其耐受性進行研究，為將乳酸菌的 抗氧化作用應(yīng)用于功能性食品或保健品的開發(fā)和生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一是篩選出一株高抗氧化活性植物乳桿菌，分析其抗氧化機理， 并對其耐受性進行研究，為將該菌的抗氧化作用應(yīng)用于功能性食品或保健品的開發(fā)和生產(chǎn) 奠定基礎(chǔ)。
[0006] 本發(fā)明提供一株具高抗氧化活性的植物乳桿菌，該菌命名為植物乳桿菌 BLCC2-0015 (Lactobacillus plantarum BLCC2-0015)，保藏編號為 CCTCC N0:M2015126,保 藏日期為2015年3月18日，保藏于中國武漢，武漢大學，中國典型培養(yǎng)物保藏中心。
[0007] 本發(fā)明還提供一種上述植物乳桿菌BLCC2-0015,在制備用于機體抗氧化的食品或 保健品中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明再提供一種用于機體抗氧化的食品或保健品，其特征在于，包括上述植物 乳桿菌 BLCC2-0015。
[0009] 進一步的，將所述植物乳桿菌BLCC2-0015制備成菌粉與載體混勻即可。
[0010] 進一步的，所述菌粉通過以下步驟得到的：
[0011] 取植物乳桿菌BLCC2-0015凍干粉菌種；
[0012] 將所述凍干粉菌種接種于固體斜面培養(yǎng)基上活化；
[0013] 取活化后的固體斜面培養(yǎng)基，在無菌條件下接種于種子液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到 一級種子液；
[0014] 將所述一級種子液接種于另一種子液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到二級種子液；
[0015] 將所述二級種子液接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵；
[0016] 待所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵液黏度達12000-15000cP時，收集發(fā)酵液；
[0017] 將所述發(fā)酵液干燥得到菌粉成品。
[0018] 進一步的，所述發(fā)酵液干燥得到菌粉成品的步驟為將所述發(fā)酵液離心并用清水清 洗，如此重復(fù)2-3遍后冷凍干燥，粉碎，即為菌粉成品；或發(fā)酵結(jié)束后，將所述發(fā)酵液立即噴 霧干燥，得菌粉成品。
[0019] 進一步的，所述種子液體培養(yǎng)基包括：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L 和酵母膏5g/L，調(diào)節(jié)pH至5. 5-6. 5,115°C條件下滅菌20min ;所述得到一級種子液和所述 得到二級種子液的培養(yǎng)條件均為30-37°C靜置培養(yǎng)12-16h。
[0020] 進一步的，所述固體斜面培養(yǎng)基為所述種子液體培養(yǎng)基中添加1. 5-2. 0%的瓊脂 粉；菌種活化條件為30-37°C培養(yǎng)20-30h。
[0021] 進一步的，所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏IOg/ U酵母膏5g/L、乙酸鈉5g/L、檸檬酸銨2g/L、磷酸氫二鉀5g/L、硫酸鎂0. 5g/L、硫酸錳 0. 2g/L和吐溫-801mL/L，使用時，調(diào)節(jié)pH至5. 5-6. 5 ;所述發(fā)酵條件為30-37°C條件下，靜 置培養(yǎng)10-24h。
[0022] 進一步的，所述一級種子液和二級種子液的接種量均為1-5%。
[0023] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的具高抗氧化活性的植物乳桿菌從眾多乳酸菌中 篩選得到的，不僅具高抗氧化活性，還可以具有良好的耐酸耐膽鹽特性。將該菌菌粉制成機 體抗氧化食品或保健品，直接食用或沖服飲用，使用方便，可增強機體免疫力。
[0024] 本發(fā)明提供的可用于抗氧化的乳桿菌命名為植物乳桿菌 BLCC2-0015 (Lactobacillus plantarum BLCC2-0015)，已于 2015 年 3 月 25 日保藏于中國 典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC N0:M2015126。
【附圖說明】
[0025] 圖1為本發(fā)明植物乳桿菌BLCC2-0015的生長曲線；
[0026] 圖2為菌株BLCC2-0015的菌體形態(tài)（油鏡觀察）；
[0027] 圖3為菌株BLCC2-0015PCR擴增產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳結(jié)果；
[0028] 圖4為菌株BLCC2-0015的系統(tǒng)進化分析；
[0029] 圖5為菌株BLCC2-0015對膽鹽耐受性結(jié)果。
【具體實施方式】
[0030] 下文將結(jié)合具體附圖詳細描述本發(fā)明具體實施例。應(yīng)當注意的是，下述實施例中 描述的技術(shù)特征或者技術(shù)特征的組合不應(yīng)當被認為是孤立的，它們可以被相互組合從而達 到更好的技術(shù)效果。
[0031] 實施例1
[0032] 1、乳酸菌的分離純化
[0033] 取適量泡菜至80mL MRS培養(yǎng)基中37°C富集培養(yǎng)20h，取培養(yǎng)液于含0&〇)3的MRS 瓊脂培養(yǎng)基上劃線，37°C恒溫靜止培養(yǎng)24h后，挑取培養(yǎng)基上具有明顯透明圈的單菌落，經(jīng) 革蘭氏染色和接觸酶反應(yīng)，挑出革蘭氏染色陽性、接觸酶陰性菌株斜面保存。
[0034] 2、具有抗氧化活性乳酸菌的篩選
[0035] 2. 1乳酸菌的培養(yǎng)及發(fā)酵液的制備
[0036] 乳酸菌在MRS液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)24h，6000r/min，4°C離心10min，收集上清液 即為發(fā)酵液。
[0037] 2. 2乳酸菌在不同濃度H2O2溶液中的耐受能力測定
[0038] 在IOOmL滅菌的三角瓶中加入60mL的MRS液體培養(yǎng)基，分別添加過氧化氧溶液， 使培養(yǎng)基中的起始H2O2濃度分別為0. 4mmol/L、0. 7mmol/L和1.0 mmol/L，并按1 %的接種 量接入分離所得的菌株培養(yǎng)液，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，取樣測定值，觀察每株菌 在不同起始過氧化氫濃度下的生長趨勢，挑選具有過氧化氫耐受性較高的菌株進行后續(xù)實 驗。
[0039] 2. 3 DPPH清除率的測定
[0040] 2mL DPPH自由基甲醇溶液（0. 2mmol/L)中，加入2mL發(fā)酵液，室溫避光條件下反應(yīng) 30min后，3000rpm離心10min，收集上清液于517nm測吸光度，以純凈水替代乳酸菌發(fā)酵液 反應(yīng)液作為空白對照，以純凈水與甲醇1:1比例混合液調(diào)零。
[0041] DPPH 自由基清除率=[1-A517(樣品）/A517(空白）]X100%
[0042] 2. 4羥自由基· OH清除率的測定
[0043] ImL 的 PBS (pH = 7. 4)中加入 ImL 鄰菲羅啉（2. 5mmol/L)、ImL FeSO4 (2. 5mmol/L)、 H2O2 (濃度為20mmol/L)，再加入0. 5mL樣品，37°C恒溫水浴反應(yīng)I. 5h后，在536nm處測吸光 值。
[0044] 清除率（％ ) = [ (A2-A1) AA0-A1) ] X 100 %
[0045] 注：A。為不含樣品和H 202;A i為不含樣品