一株解淀粉芽孢桿菌br25及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物防治植物病害領(lǐng)域，涉及一株解淀粉芽孢桿菌BR25(BacilluSamyloliquefaciens)及其在防治橡膠樹炭疽病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 橡膠樹炭疽病是炭疽菌引起的一種常見病害，它會使橡膠樹葉脫落，嚴重時甚至 可能造成整株死亡，是橡膠樹的三大葉部病害之一。目前對于該病害的防治主要是應(yīng)用化 學(xué)農(nóng)藥進行防治，對環(huán)境造成很大影響。于是，探索生物防治的方法變得迫切。炭疽菌能夠 侵染多種植物引起炭疽病，該類病害分布廣泛，危害嚴重，是植物病理學(xué)家重點研究的對象 之一，橡膠樹炭疽病是其中危害最為嚴重的一種。橡膠樹炭疽病是由膠孢炭疽菌侵染引起 的，在海南、云南地區(qū)引起了無數(shù)橡膠樹葉片脫落，甚至整株死亡，給當(dāng)?shù)氐南鹉z產(chǎn)業(yè)發(fā)展 造成了嚴重損失。
[0003] 炭疽菌主要以菌絲體形式在病枝中越冬，在適合的條件下產(chǎn)生分生孢子作為初侵 染源。橡膠樹幼苗、幼齡樹直至成齡開割膠樹均可被炭疽菌侵染而發(fā)病。病菌能夠侵染嫩 葉、葉柄、嫩梢和果實等部位，引起嫩葉脫落、嫩梢回枯和果實腐爛，甚至形成僵果懸掛在樹 上，嚴重時會引起膠樹的重復(fù)落葉和嫩梢回枯，推遲開割時間。該病害被認為是造成天然橡 膠樹減產(chǎn)的主要原因之一。目前對于橡膠炭疽病的防治仍以化學(xué)殺菌劑為主，然而，化學(xué)農(nóng) 藥造成的病菌抗藥性、毒性和環(huán)境污染問題日益突出，成為制約農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要障 礙，生防微生物具有環(huán)境兼容性好、無毒無害的優(yōu)點，是化學(xué)農(nóng)藥的理想替代品。因此，用生 防微生物防治橡膠樹炭疽病對實現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。
[0004] 生物防治作為植物病害防治的重要組成部分，被認為是最具有發(fā)展?jié)摿Φ闹匾?治方法之一。隨著人們環(huán)保意識的加強，生物防治以其符合對環(huán)境、生態(tài)、人類健康的安全， 不污染環(huán)境，成本低廉等特征成為近年來國內(nèi)外病害綜合防治與研究熱點。近年來，橡膠樹 炭疽病的發(fā)生危害呈現(xiàn)越來越嚴重的趨勢。由此可見，開展對橡膠樹炭疽病生防菌篩選研 究是如今橡膠樹生產(chǎn)過程中一項迫切的任務(wù)。
[0005] 從橡膠植株內(nèi)分離篩選獲得對橡膠樹炭疽病菌具有拮抗作用的生防菌株， 對橡膠樹炭疽病的防治具有重要的意義，但目前相關(guān)技術(shù)仍然很薄弱甚至空白，至今 有效防治橡膠樹炭疽病的拮抗細菌未見報道，也沒有防治橡膠樹炭疽病的生物農(nóng)藥的 報道。本發(fā)明的目的針對現(xiàn)有技術(shù)的空白提供一株解淀粉芽孢桿菌BR25(BacillUSamyloliquefaciens)及其在防治橡膠樹炭疽病中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的針對現(xiàn)有技術(shù)的空白提供一株解淀粉芽孢桿菌BR25(BacilluSamyloliquefaciens)及其在防治橡膠樹炭疽病中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)。
[0008] 本發(fā)明采用的細菌是解淀粉芽孢桿菌BR25菌株，分類命名為解淀粉芽孢桿菌 Bacillus amyloliquefaciens，已于2015年06月05日保藏于中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心（CGMCC)，地址：中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微 生物研究所，郵編100101 ;保藏編號為CGMCC NO. 10962。
[0009] 本發(fā)明的生產(chǎn)菌株BR25分離自海南省儋州市寶島新村的橡膠植株葉片，經(jīng)菌落 和形態(tài)的顯微觀察、染色反應(yīng)、常規(guī)生理生化特性試驗以及16s rDNA序列分析，該菌株鑒定 為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)的一個新菌株，具有以下特征：①菌株 呈直桿狀，常以成對或鏈狀排列，具圓端或方端；芽孢橢圓、卵圓、柱狀、圓形，無莢膜；革蘭 氏染色陽性；②通過甲基紅實驗、酪氨酸分解實驗、V-P實驗、檸檬酸鹽生長實驗等生理生 化指標，并結(jié)合《伯杰細菌鑒定手冊》，鑒定結(jié)果BR25屬于枯草芽孢桿菌屬，結(jié)果與分子鑒 定一致。
[0010] 該解淀粉芽孢桿菌BR25的基本培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基或者YEP培養(yǎng)基。
[0011] 該解淀粉芽孢桿菌BR25的可利用碳源有：山梨醇、鼠李糖、維生素 C、蘇氨酸、半乳 糖、脯氨酸、甘露醇、麥芽糖、胱氨酸、可溶性淀粉、葡萄糖、酪氨酸、果糖。
[0012] 本發(fā)明還研究了菌株BR25對不同抗生素的敏感性，為化學(xué)防治打下基礎(chǔ)。
[0013] 本發(fā)明的菌株BR25對柱花草炭疽菌、橡樹炭疽菌、胡椒枯萎鐮刀菌具有抑制作 用。
[0014] 本發(fā)明的菌株BR25或其發(fā)酵液可以作為生物防治制劑使用，用于防治植物真菌 病害。
[0015] 本發(fā)明還提供一種解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)BR25的應(yīng)用， 該菌株可以用于防治橡膠樹炭疽病、柱花炭疽病和胡椒枯萎鐮刀菌。
[0016] 本發(fā)明還提供一種植物真菌病害的生物防治方法，向具有真菌病害的植物施用 菌株BR25或其發(fā)酵液，也可以施用含有上述菌株或其發(fā)酵液的生物防治制劑，也可以與其 他生物防治制劑聯(lián)合施用。
[0017] 本發(fā)明的菌株BR25具有廣譜抗菌性，培養(yǎng)簡單，適應(yīng)性強，抗菌能力穩(wěn)定，可以廣 泛應(yīng)用于多種植物真菌病害的防治。
【附圖說明】
[0018] 圖1為BR25和其他生防菌的16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳圖，泳道M為DNA marker，4 為 BR25,5 為 BR23,6 為 BR24,7 為 BR26。
[0019] 圖2為菌株BR25的革蘭氏染色結(jié)果。
[0020] 圖3為菌株BR25第1-10代的拮抗效果圖。
[0021] 圖4為菌株BR25對橡膠樹炭疽菌的抑制作用。
[0022] 圖5為菌株BR25對胡椒枯萎病鐮刀菌的抑制作用。
【具體實施方式】 [0023] 實施例1
[0024] 菌株BR25的分離培養(yǎng)和篩選純化。
[0025] I. 1 采樣
[0026] 樣品為海南省儋州市寶島新村的橡膠植株葉片，將采集好的葉片放入塑料袋中并 記錄。
[0027] I. 2材料表面消毒與拮抗細菌分離
[0028] I. 2. 1清水沖洗與剪取病葉
[0029] 用清水洗去葉片上的灰塵砂礫，晾干。用剪刀在病健交界處剪取大小為5 X 5mm的 小葉片備用。
[0030] 1.2. 2樣品消毒
[0031] 將剪取的小病葉放入燒杯，用升汞浸泡30秒，在浸泡的過程中應(yīng)注意不斷輕輕攪 動小病葉，然后用無菌水沖洗三次，晾干，備用。
[0032] 1. 3細菌分離培養(yǎng)
[0033] 用滅過菌的鑷子將剪取的小葉片貼放到PDA固體培養(yǎng)基上，每皿均勻擺放4 ±夬，再 將培養(yǎng)皿用保鮮膜密封。倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中，28°C培養(yǎng)。每隔12h進行觀察48h后將 長出的菌體轉(zhuǎn)接至相同的培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h后進行純化；同時，將純化后所得的細菌 采用梯度稀釋涂布LB平板培養(yǎng)基中，28 °C培養(yǎng)48h后挑取單菌落接至相應(yīng)培養(yǎng)基斜面上。
[0034] 1. 4拮抗細菌的篩選
[0035] 1.4.1細菌的純化
[0036] 無限稀釋法：將放置于8~KTC培養(yǎng)箱中的斜面試管取出，在無菌操作臺中，將 液體LB培養(yǎng)基分裝到錐形瓶中，然后用接種針挑去少量的細菌于錐形瓶中，封口。放置于 28°C搖床上震蕩培養(yǎng)約12小時，取出。然后用移液器吸取200 yL于LB固體培養(yǎng)基上，涂 抹棒涂抹均勻，于28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。然后再通過無限稀釋法處理獲得單一菌株。
[0037] 或者采用劃線純化法：
[0038] 如果要挑的菌落很小，而且又長得慢，菌落全部粘到接種環(huán)上，劃線時可適當(dāng)增加 第二梯度線的寬度和劃線數(shù)，因為當(dāng)菌少時，拉不開4個梯度，而第二梯度可較好的分離出 單菌落。如果要挑的菌落很大，而且又長得快，可挑菌少些，第一梯度線要多劃幾下，且占地 要小。第二梯度線劃得少且密一些，第三和第四梯度線則劃得多且疏，因為這些菌主要靠第 三和第四梯度線分離單菌落。第二梯度2~3條線與第一梯度線連接，第三與第二梯度線 也是2~3條線連接。在第二與第三梯度劃線前將接種環(huán)灼燒冷卻，這樣可燒死粘在接種 環(huán)上的細菌。
[0039] 實施例2
[0040] 菌株BR25的鑒定
[0041] 1、微生物學(xué)特性：
[0042] 對在37°C培養(yǎng)箱中劃線培育的生防菌株進行形態(tài)特征觀察，發(fā)現(xiàn)生防菌株BR25 呈直桿狀，較少成鏈，具圓端或方端；芽孢橢圓、卵圓、柱狀、圓形，無莢膜，為芽孢桿菌屬。經(jīng) 革蘭氏染色后菌體均呈現(xiàn)出藍紫色，為革蘭氏陽性菌。
[0043] 2、分子生物學(xué)鑒定：
[0044] (I) DNA提?。翰捎帽绢I(lǐng)域通用的試劑盒進行基因組DNA的提??；
[0045] (2)PCR反應(yīng)：細菌通用引物8F和1492R，由英濰捷基（上海）貿(mào)易公司合成，結(jié)構(gòu) 如下：8F 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
[0046] 1492R 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' ，