一種芽孢桿菌Bacillus sp. CAMT22370及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種微生物篩選及發(fā)酵領域，具體涉及你 CiWM耶CAMT22370及其 液體發(fā)酵產葡萄糖氧化酶的方法。
【背景技術】
[0002] 葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GOD ;EC I. L 3. 4.)利用氧分子作為電子受體， 專一性地將β -D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和過氧化氫，從而有效地將氧去除。由于其天然 無毒副作用而被廣泛地用于食品加工、醫(yī)藥及生物領域?；谄洫毺氐拿撗跣Чa生的 保鮮作用，目前已在水果、面制品、酒類、乳品等領域廣泛應用。馬清河等已初步嘗試將商品 化的葡萄糖氧化酶應用于對蝦保鮮，結果表明在4°C的冷藏條件下較對照延長了約1天的 保鮮期，預示著葡萄糖氧化酶在對蝦保鮮領域將會產生良好的效果。
[0003] 目前葡萄糖氧化酶的工業(yè)化生產主要采用陸生黑曲霉或青霉固體或液態(tài)發(fā)酵，但 在發(fā)酵過程中存在表達量較低以及雜蛋白較多的缺陷，給分離純化帶來很大困難，導致產 品成本增高，是制約該酶在食品領域廣泛應用的限制因素。目前我國生產的葡萄糖氧化酶 工業(yè)酶制劑純度普遍較低，長期以來依賴進口，因此尋找葡萄糖氧化酶進口酶制劑的替代 產品具有重要現(xiàn)實意義。同時，已報道的陸生菌株來源葡萄糖氧化酶最適溫度多在30-40Γ 的溫度范圍，而在O-KTC的食品冷鏈溫度下活力相對較低，保鮮效果不佳。

【發(fā)明內容】

[0004] 基于目前葡萄糖氧化酶生產菌株陸生來源所存在的產酶活力較低、低溫條件下活 性不強，以及發(fā)酵產物雜蛋白含量較高的局限性，本發(fā)明提供了一種從海洋資源中分離低 溫葡萄糖氧化酶高產菌株的方法及其產葡萄糖氧化酶的應用。
[0005] 本發(fā)明目的之一是提供了一種可產低溫葡萄糖氧化酶的海洋菌株。
[0006] 本發(fā)明目的之二是提供了一種利用目標菌株產低溫葡萄糖氧化酶的應用。
[0007] 為此，本發(fā)明提供了 一株芽孢桿菌（你 ciWM 6^)CAMT22370,保藏于中國典型 培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC N0:M2015247。本發(fā)明的芽孢桿菌萬aciWiA?耶. CAMT22370是可生產低溫葡萄糖氧化酶的深海菌株，該菌于2015年4月27日保藏于中國 典型培養(yǎng)物保藏中心，該保藏中心簡稱為CCTCC，保藏單位地址為武漢市武昌珞珈山武漢大 學，保藏編號為CCTCC No: Μ2015247。
[0008] 本發(fā)明的芽孢桿菌CCTCC NO: M2015247可采用含蛋白胨和酵母膏的培養(yǎng)基進行 培養(yǎng)，例如：蛋白胨5g，酵母膏l(xiāng)g，硫酸亞鐵0. lg，天然海水1L，pH7. 6-7. 8。
[0009] 本發(fā)明還提供了上述芽孢桿菌在發(fā)酵生產葡萄糖氧化酶中的應用。
[0010] 優(yōu)選地，所述葡萄糖氧化酶在低溫（0~10°c)下活力大于4U/mL。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種葡萄糖氧化酶的制備方法，其采用芽孢桿菌 CAMT22370發(fā)酵制得。優(yōu)選地，所述發(fā)酵為液體發(fā)酵。
[0012] 本發(fā)明通過單因素試驗對芽孢桿菌CAMT22370液體發(fā)酵產葡萄糖 氧化酶的條件進行了優(yōu)化。
[0013] 本發(fā)明公開了芽孢桿菌你 CiWM耶.CAMT22370產葡萄糖氧化酶的條件，其培 養(yǎng)、發(fā)酵條件簡單，遺傳性質穩(wěn)定。該菌株來源于深海，其發(fā)酵最適碳源為麥芽糖，氮源譜 廣，但以有機氮為佳，常規(guī)無機鹽種類對產酶活力影響不顯著，以添加0. 05%質量比的CaCl2較為適宜。例如：麥芽糖5g，酵母粉10g，氯化媽2. 8g，氯化鈉 lg，吐溫-80 I. 5mL，去離子水 lL，pH7. 5。發(fā)酵條件可以是：接種量2~10%體積分數(shù)，產酶溫度22~37°C，發(fā)酵時間36~84h， 轉速0~250rpm ;更優(yōu)選地，接種量為6~8%(體積分數(shù))，產酶溫度30~35°C，發(fā)酵時間40~72h， 轉速150~250rpm。最優(yōu)選地，發(fā)酵時適宜接種量為7% (體積分數(shù))，產酶溫度為31°C，適宜 發(fā)酵時間為60h，適宜轉速為200rpm，此時酶活力達到13U/mL以上。
[0014] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明提供的芽孢桿菌你 CiWiAS CAMT22370能夠產生低溫葡萄糖氧化酶，該酶在 〇~l〇°C的食品冷鏈溫度下的酶活相對于傳統(tǒng)黑曲霉等來源的葡萄糖氧化酶顯著提高，從而 大幅改善在低溫下的保鮮效果，十分適合用于水產品的低溫保鮮，特別是對蝦等水產食品 的物流保鮮。也可應用于水果、面制品、酒類、乳品等領域的保鮮。在用于保鮮時，可用本發(fā) 明的低溫葡萄糖氧化酶取代傳統(tǒng)的葡萄糖氧化酶制備保鮮劑，在捕撈后清洗過程中通過浸 泡5~15min處理對蝦，然后瀝干含酶保鮮劑，其余保鮮技術和手段可保持不變。
[0015] 不僅如此，本發(fā)明提供的芽孢桿菌你 CiWM耶.CAMT22370菌株還能夠高產低溫 葡萄糖氧化酶。
[0016] 現(xiàn)階段商品化的葡萄糖氧化酶都是由霉菌發(fā)酵產生，存在產酶活力低及分離復雜 的缺陷。以芽孢桿菌CAMT2237進行發(fā)酵，產生的低溫葡萄糖氧化酶不僅酶 活力高，而且分離容易。
[0017] 本發(fā)明提供的芽孢桿菌CAMT22370遺傳穩(wěn)定性好，能夠穩(wěn)定地保持 其高產低溫葡萄糖氧化酶的優(yōu)良性狀。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種葡萄糖氧化酶的制備方法，通過在傳統(tǒng)發(fā)酵產葡萄糖氧化酶 的工藝中，采用芽孢桿菌你 CiWys CAMT22370來進行發(fā)酵，能夠高產大量的低溫葡萄 糖氧化酶。發(fā)酵過程簡單易行，同時產量和生產效率都獲得了大幅的提高。
【附圖說明】
[0019] 圖1為碳源種類對CAMT22370產葡萄糖氧化酶活力的影響圖； 圖2為氮源種類對CAMT22370產葡萄糖氧化酶活力的影響圖； 圖3為無機鹽種類對你 CiWM耶.CAMT22370產葡萄糖氧化酶活力的影響圖； 圖4為裝液量對CAMT22370產葡萄糖氧化酶的影響圖； 圖5為接種量對CAMT22370產葡萄糖氧化酶的影響圖； 圖6為發(fā)酵溫度對CAMT22370產葡萄糖氧化酶的影響圖； 圖7為發(fā)酵時間對CAMT22370產葡萄糖氧化酶的影響圖； 圖8為轉速對6·α CAMT22370產葡萄糖氧化酶的影響圖； 圖9為含酶發(fā)酵液對對蝦冷藏過程中黑變進程的影響圖； 圖10為含酶發(fā)酵液對對蝦冷藏過程中微生物繁殖速度的影響圖。
【具體實施方式】
[0020] 在本發(fā)明中，酶活力的定義為每分鐘催化產生I. 0 yg H2O2的量即為一個酶活力 單位。除在特定背景下或特別說明，酶活力均在室溫（25°C)下測定。
[0021] 以下實施例采用的培養(yǎng)基為： 富集及種子培養(yǎng)基:蛋白胨5g，酵母膏l(xiāng)g，硫酸亞鐵0. lg，天然海水1L，pH7. 6-7. 8。
[0022] 發(fā)酵培養(yǎng)基：麥芽糖5g，酵母粉10g，氯化鈣2. 8g，氯化鈉 lg，吐溫-80 I. 5mL，去 尚子水1L，ρΗ7· 5。
[0023] 實施例1:產葡萄糖氧化酶菌株的篩選 本發(fā)明芽孢桿菌CAMT22370的篩選方法包括以下步驟： (1)細菌的富集:稱取Ig海泥于9ml的無菌海水試管中震蕩均勻，靜置，取上清液逐級 稀釋至10 2, 10 3, 10 4倍，震蕩均勻后各取ImL不同濃度的樣液分別接種至各培養(yǎng)基中，放 于30 °C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。
[0024] (2)初篩:將富集菌體稀釋至約10 VmL濃度，根據(jù)產物H2O2可將亞甲基藍氧化為無 色，設計含有亞甲基藍濃度梯度的顯色培養(yǎng)基，將稀釋菌懸液采用稀釋涂布法接種于顯色 培養(yǎng)基，在30°C下培養(yǎng)48h后根據(jù)菌體周圍無色透明圈的大小初步判定產葡萄糖氧化酶活 力高低，挑選若干菌株進行后續(xù)搖瓶發(fā)酵復篩。
[0025] (3)復篩:復篩主要采用酶標儀對初篩菌株的發(fā)酵液中的葡萄糖氧化酶活力進行 快速比較篩選。利用葡萄糖氧化酶37°C催化葡萄糖產生的H2O2可使靛藍胭脂紅褪色，其褪 色程度在一定范圍內與產生的H2O2量呈正相關，據(jù)此通過標準曲線計算出催化產物H2O 2量， 評價酶活力高低。酶活力的定義為每分鐘催化產生1.0 yg H2O2的量即為一個酶活力單 位。可溶性蛋白測定采用考馬斯亮藍G-250法測定。
[0026] 實施例2產葡萄糖氧化酶菌株的鑒定 對實施例1篩選出的菌株，采用形態(tài)學和分子生物學方法對其進行鑒定。
[0027] 形態(tài)鑒定主要采用菌落形態(tài)和顯微形態(tài)進行觀察，生理生化鑒定根據(jù)菌株的代謝 歷程采用糖酵解試驗、淀粉水解試驗、V-P試驗、甲基紅試驗、氧化酶試驗、三糖鐵瓊脂試驗 和硫化氫靛基質-動力瓊脂試驗的方法進行，分子生物學鑒定采用16SrDNA測序與比對的 方法進行鑒定。綜合對形態(tài)、生理生化和生物分子學鑒定結果進行菌株歸屬。
[0028] 其中，分子生物學鑒定首先采用細菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA，然后采用 通用引物進行PCR擴增，擴增體系及程序按常規(guī)操作參數(shù)，PCR產物純化后完成測定的16S rDNA基因基因片段長度為1492bp，經比對，與你 CiWys耶相似性最高，同源性達100%。
[0029] 結果顯示，篩選得到的菌株具有以下特征：（1)菌落形態(tài)：白色，直徑較小，呈圓 形，表面光滑，低凸起，較透明，邊緣整齊；（2)細胞形態(tài)：桿狀，單個排列，單端生鞭毛，革蘭 氏陽性；（3):生理生化特征：生長溫度為4-40°C，好氧，能耐受7% (wt)氯化鈉，能水解明 膠、淀粉、酪素，能利用硫酸銨、硝酸銨、D-氨基葡萄糖，可利用糖原、麥芽三糖、D-海藻糖、 D-核糖為碳源，不能利用菊粉、D-甘露糖、L-鼠李糖、D-半乳糖、甘露醇和木糖，吲哚反應為 陰性，甲基紅試驗、接觸酶、氧化酶和β -N-乙酰氨基葡糖苷酶試驗為陽性，產過氧化氫酶， 不產硫化氫。
[0030] 該菌株經16S rDNA鑒定，測得基因片段長度為1492bp。將獲得的基因序列輸入 Genbank，應用Blast程序將獲得的基因序列與數(shù)據(jù)庫中基因序列進行對比。結果顯示，與 芽孢桿菌你 ciWM耶的16S rDNA序列的同源性為100%。將此結果結合菌株形態(tài)學及生理 生化鑒定特征，確定該菌為芽孢桿菌5/7,將其保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏編號為 CCTCC NO: M2015247。
[0031] 實施例3芽孢桿菌CAMT22370液體發(fā)酵產葡萄糖氧化酶條件優(yōu)化 本實驗對篩選得到的芽孢桿菌CAMT22370的產酶條件進行了優(yōu)化。具體而言，主要是 對液體發(fā)酵產葡萄糖氧化酶的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。除非特別說明，以下百分數(shù)為 重量百分數(shù)。
[0032] 碳源種類的篩選:在0. 3%牛肉膏，0. 5%氯化鈉的基礎上，以1%的添加量分別加入 葡萄糖，乳糖，蔗糖，麥芽糖，山梨醇，甘露糖，制成只含某一碳源的培養(yǎng)基。發(fā)酵接種量為5% (體積比)，轉速150rpm，28°C恒溫發(fā)酵培養(yǎng)72h，測